1 分子生物学技术
表 1列举了常用于研究水处理微生物种群结构的主要分子生物技术、初期重要技术文献及该种技术的特点。
表 1 微生物种群结构研究采用的主要分子生物技术
研究内容
代表技术
初期重要技术文献
基本原理
备注
多样性分析
DGGE/TGGE
1993 年 G.Muyzer 等初次应用 DGGE 技术分析(Analyse)复杂的微生物种群结构
对 16SrRNA 进行扩增袁通过 DGGE/TGGE 对扩增产物进行分析
应用最为广泛的技术之一 , 重现性与灵敏度差
SSCP
1996 年 D.H.Lee 等首次采用 PCR-SSCP 技术分析自然生态系统的微生物菌群结构
利用 DNA 单链构象的多态性袁根据非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移率的不同来分析(Analyse) DNA 单链中的基因突变
在突变检测上应用较多 , 微生物群落结构解析研究较少
RISA
1996 年 V.G 俟 rtler 等采用 16S-23SrDNA 间隔片段区分和识别细菌
以细菌 16S 和 23SrDNA 间隔片段 为研究对象袁 ITS 的 PCR 扩增产物用电泳分离可以获得特异性的长度多态性图谱
ITS 长度的特异性理论上可以表现出较大的多样性
ARDRA
1992 年 M.Vaneechoutte 等初次建立了 ARDRA 分析方法
选择性扩增 rDNA 片段袁再对 rDNA 进行限制性酶切片段长度多态性分析(Analyse)。
快速有效袁用 OTUs 多样性估计最低限度细菌（fungus)种的数目
T-RFLP
1994 年 C.L.Moyer 等采用 RFLP 研究深海活火山口微生物多样性 ;1997 年 W.T.Liu 等首先将 T-RFLP 技术用于微生物群落分析
综合 PCR 技术尧 DNA 限制性酶切技术尧荧光标记技术和 DNA 序列自动分析技术袁对特定核酸片段长度多态性进行测定
主要应用于微生物群落组成和结构尧微生物系统发育及菌种鉴定研究
菌种鉴定
FISH
1989 年袁 E.F.DeLong 等用荧光标记的寡核苷酸探针来探测独立的微生物细胞
将待测微生物核酸分子变性后袁利用荧光标记的探针袁与细胞内碱基互补配对袁在一定激发波长下用显微手段测定微生物的分布与数量
应用最为广泛(extensive)的技术之一 , 杂交和洗涤步骤的条件优化十分困难
16SrRNA 克隆文库技术
1990 年 S.J.Giovannoni 等初次采用针对 16SrRNA 基因的克隆文库技术对 SargassoSea 微生物进行分析
将微生物细胞 16SrRNA 特异扩增后 , 对核苷酸序列测定袁测定结果与已知序列比较袁鉴定微生物种属
应用最为广泛的技术之一 , 准确度高 . 需专业人员和设备 , 不适合高通量分析
基因芯片(又称微电路)技术
1991 年 S.P.Fodor 等初次提出生物芯片渊 Biochip 冤概念 ;1995 年 M.Schena 等用 DNA 微阵列技术并行检测拟南芥多个基因的表达水平
综合原位杂交技术尧微电子技术、高分子化学合成技术和计算机技术 , 对杂交信号的强度进行分析
设备复杂袁但可集成打包处理
定量分析
实时定量 PCR
1996 年 C.A.Heid 等初次研发了一种实时定量 PCR 方法 , 相比于定量 PCR 操作更加简便精确
在 PCR 反应中加入荧光基团袁通过检测荧光信号的变化来监测 PCR 扩增过程
核酸检测和定量的精确方法
注： DGGE/TGGE 为变性 / 温度梯度凝胶电泳； SSCP 为单链构象多态性； RISA 为核糖体基因间隙分析(Analyse)； ARDRA 为扩增性 rDNA 限制性酶切片段分析； T-RFLP 为末端限制酶切片段长度多态性分析； FISH 为荧光标记原位杂交。膜生物反应器膜分离技术与生物处理技术有机结合之新型态废水处理系统。以膜组件取代传统生物处理技术末端二沉池，在生物反应器中保持高活性污泥浓度，提高生物处理有机负荷，从而减少污水处理设施占地面积，并通过保持低污泥负荷减少剩余污泥量。主要利用沉浸于好氧生物池内之膜分离设备截留槽内的活性污泥与大分子有机物。膜生物反应器系统内活性污泥（MLSS）浓度可提升至8000~10,000mg/L，甚至更高；污泥龄(SRT)可延长至30天以上。
2 分子生物学技术在污水处理中的应用
2.1 不同种类污水在同一处理工艺中的微生物种群比较
污水种类是决定活性污泥种群结构的重要因素。张斌等采用DGGE技术对处理浴池游泳馆污水、学生公寓污水、医院污水和人工配水4种污水的膜生物反应器污泥种群结构进行了研究，比较了总细菌和氨氧化（oxidation)细菌，并对优势菌进行了16S rDNA克隆测序。结果表明，4个MBR中既存在共有的微生物种属，但优势地位并不相同，又存在各自独特的种属，同源性分析显示优势种群以Proteobacteria纲和Bacillus属为主，对氨氮降解起主要作用的细菌群落属于相同的种属，且都处于顶级地位；反应器中存在着多种氨氧化菌属，其中以亚硝化单胞菌属最为普遍，并且鉴定出2种反硝化菌属，菌落中含有的亚硝化菌属表明生物处理过程中含有多种硝化和脱氮途径。N. Boon等使用16S rRNA作引物结合DGGE 技术和统计学方法分析生活污水、造纸厂废水、食品厂废水以及纺织厂工业废水的活性污泥中微生物菌群结构，研究结果表明，DGGE和16S rRNA技术不仅可用于比较微生物群落间的差异，同时也可作为一种工具以改善污水处理过程中的监测和控制，改进处理不同种类废水的活性污泥工艺。
2.2 不同生物处理工艺中的微生物种群研究
2.2.1 活性污泥工艺
活性污泥工艺是污水处理中最常见的工艺，应用广泛。Xinchun Liu等使用DGGE技术对两个分别采用缺氧/厌氧/好氧工艺和A/O工艺的水处理厂进行研究，结果表明两个生物处理系统具有相似的细菌种群结构，原水中的优势（解释:能压倒对方的有利形势)菌落并不是活性污泥的优势菌落，处理效果好的系统与效果较差系统中的细菌种群结构类似。王晓慧等采用基于16S rRNA基因的T-RFLP技术分析处理相同原水的
A、B两套污水处理系统中的微生物群落结构，其中A为A2/O工艺，B为倒置A2/O工艺。结果表明，出水稳定的两套污水处理系统中特殊结构：荚膜、鞭毛、菌毛的群落结构均发生了显著变化，该结论与A. Briones等对工程环境下微生物种群结构的过程稳定性研究所得结论相对应，即生态系统中存在多种功能相近的菌种，在环境条件发生变化的情况下弱势菌种会转变为优势菌种并形成新的平衡，维持生态系统稳定。
2.2.2 生物膜工艺
生物膜法是利用微生物附着生长在填料或载体表面，形成膜状的活性污泥。肖勇等为了研究处理垃圾渗滤液的序批式生物膜反应器中的特殊结构：荚膜、鞭毛、菌毛多样性，采用DGGE技术进行分析，对凝胶染色并进行条带统计分析、切胶测序、同源性分析同时建立了系统树。结果表明，该SBBR中有多种硝化细菌与反硝化细菌、好氧(Oxygen)反硝化细菌和厌氧氨氧化细菌共存，反应器中可能同时存在全程硝化反硝化、同步硝化反硝化和厌氧氨氧化3种脱氮方式。
2.2.3 膜生物工艺
膜生物反应器是现代膜分离技术结合传统生物处理技术产生的一种高效水处理工艺。牟洁等使用PCR-DGGE技术考察了天津某再生水处理厂MBR的培养驯化直至正常运行全过程细菌群落结构的演替情况，结果表明在整个污泥驯化过程中，微生物群落遭受了冲击，最终趋于稳定，并形成了新的特有的微生物群落生态系统，证明其中的优势菌种在去除有机物过程中起到关键作用。A. C. Cole等对好氧膜生物反应器与活性污泥工艺进行了比较研究，结果表明MABR比常规活性污泥系统有更丰富的微生物种群，且对于去除废水中的含氮、含碳有机物有巨大潜能。
2.2.4 其他类型生物处理工艺
Shuo Feng等将amoA基因的T-RFLP分析与克隆和序列分析相结合，研究中试规模的颗粒活性炭-砂子双重过滤器中氨氧化古细菌和氨氧化细菌混合菌群的空间异质性。中空纤维膜纺丝机外形像纤维状，具有自支撑作用的膜。它是非对称膜的一种，其致密层可位于纤维的外表面／如反渗透膜，也可位于纤维的内表面(如微滤膜和超滤膜)。对气体分离膜来说，致密层位于内表面或外表面均可。结果表明颗粒活性炭样品上的氨氧化细菌菌群随样品在过滤器中深度的变动而变化。而且，亚硝化单胞菌及其类微生物是颗粒活性炭样品中的优势氨氧化细菌菌种。 Xiaolei Liu等对处理中国传统医药工业废水的厌氧折流反应器中4个不同隔断的微生物种群结构进行研究，研究分3个阶段：DGGE结果显示正常负荷条件下，在有机负荷增高阶段，4个隔断中同一取样时间的微生物样本种群结构并不相同，同一隔断中不同取样时间的微生物样本种群结构也不相同；在OLR稳定阶段，隔断中的微生物种群结构趋于相似；在OLR超负荷运转阶段，隔断中的微生物种群结构变化应对水质变化的机能被破坏，出水水质迅速恶化，微生物种群结构与稳定段相比变化显著。
王峰等对比研究了城市污水化学生物絮凝强化一级处理工艺与传统完全混合式处理工艺反应池的活性污泥样品微生物种群结构，证明化学生物絮凝处理工艺的微生物作用机理与成分相近的完全混合式处理工艺中微生物的作用机理可能存在相当大的差别。
2.3 菌株的鉴定(同义词:判定、判断、判决)及在生物强化技术中的应用
分子生物技术可从微观角度更细致地了解污染物的降解机制。膜生物反应器在污水处理，水资源再利用领域，MBR又称膜生物反应器（Membrane Bio-Reactor ）,是一种由膜分离单元与生物处理单元相结合的新型水处理技术。FISH技术是活性污泥菌株鉴定中应用最为广泛的技术之一，该技术结合显微镜的可视性，通过(tōng guò)激发杂交探针的荧光来检测(检查并测试)信号，从而对未知的核酸序列进行检测，结果可直接在荧光显微镜下观察。S. Hallin等采用FISH和DGGE技术分析活性污泥处理系统中氨氧化细菌的群落组成，并用Quantitative-FISH定量分析，研究发现FISH 法可确定AOB中与种群数量相关的Nitrosomonas europaea和Nitrosomonas oligotropha两种优势菌群，而DGGE法只能检测到后者。16S rDNA克隆测序技术是另一种广泛使用的菌株鉴定技术，Shunni Zhu等成功从活性污泥中分离出一种喹啉降解菌株，通过16S rDNA测序绘制系统树，解析出其具体菌属，并通过实验进一步验证其降解喹啉的性能。
利用分子生物技术筛选有价值的功能微生物并加以培养利用可有效提高污水处理效果。邢林林等采用RISA技术解析了一个处理溴氨酸废水的生物反应器在投加高效菌前后的污泥系统群落变化，分析(Analyse)表明高效菌可以在系统中稳定存在，且不对原菌群结构造成较大影响。Fang Ma等采用生物强化方法升级一个炼油废水生物处理系统，通过PCR-TGGE技术对系统内的微生物菌群结构进行分析。结果表明，系统内优势菌的种群数和种类在各个阶段不尽相同，生物强化后长链烷烃浓度急剧下降，去除率达70%以上，几乎所有的苯（化学式：C6H6） 和苯系物、酯类以及醛酮类都被降解。生物强化后难降解有机物减少到32种，相比于未生物强化减少了50%。 具体参见
3 结语
与传统生物学技术相比，分子生物学技术为研究（research)水处理领域的微生物种群结构开辟了一条全新的思路，通过(tōng guò)检测污水生物处理系统中的微生物种群核酸序列多态性、鉴定个体的基因型，可以了解系统中微生物群体的多样性、实际生存状态和功能特点，可在分子水平上阐述废水生物处理的机制，对于更好地优化污水处理系统具有理论意义与应用价值。
