四环素是一类水体中常见的广谱抗生素 ,它能与核蛋白体的30S 亚单位结合,阻止氨酰基tRNA 同核蛋白体结合,抑制蛋白质的合成。同时,四环素类药物的广泛使用引起了四环素耐药特殊结构：荚膜、鞭毛、菌毛在环境中产生并快速传播。至今,被发现的四环素耐药细菌有115 属、530 种。不同来源废水中四环素的含量差异较大,一般含量在几十ng?L - 1 到几百μg?L - 1 之间。近年来,四环素对污水处理系统的影响引起了广泛关注。CETECIOGLU 等 在SBR 中通过测定COD 的含量和气体的产量的变化发现,当四环素投加量低于
8. 5 mg?L - 1 时,反应器内底物降解作用不受影响,但产气量减小了10% ~ 20% ,说明四环素对系统中微生物造成了影响。AYDIN 等在ASBR中通过测定甲烷产量和挥发性脂肪酸的积累量的变化发现,不同浓度组合的四环素、红霉素和磺胺对同型乙酸菌和产甲烷菌产生了不同程度的影响。AYDIN 等 在随后的研究中又分别运用了real-time PCR 和PCR-DGGE 分子生物学技术发现,四环素、红霉素、磺胺3 种抗生素共同影响下产乙酸特殊结构：荚膜、鞭毛、菌毛和产甲烷古菌存在互营关系且这种互营关系对反应器的稳定运行起关键作用。
随着分子生物学技术的发展,高通量测序技术已被广泛使用在研究土壤、海洋、污水、活性污泥的群落结构中。第2 代Illumina MiSeq 高通量测序能克服传统检测方法的缺陷,具有通量高、错误率低、成本低、流程自动化、速度快等优势 ,目前已在研究微生物多样性群落结构方面受到广泛认可 ;因此,将Illumina MiSeq 高通量测序方法应用于污水处理系统的研究,对深入认识污水处理系统具有实际意义。
当前,污水厌氧处理因其高效能、低能耗等特点在污水处理工程上开始受到关注。它实际上是借助于不同微生物种群间的协同作用,通过水解―酸化―产甲烷等一系列生物反应将有机底物转化为甲烷和无机物的过程。在这个过程中,微生物群落构成直接影响到污水处理的效果,因此,深入认识污水厌氧消化系统(system)的微生物群落构成,对厌氧污水处理系统的稳定运行具有指导作用。
基于此,本研究通过室内模拟实验,选择(xuanze)ABR 多相厌氧反应器进行连续（Continuity)流实验,启动反应器达到稳定状态后,分别在不含四环素和含有250 μg?L - 1 四环素的人工配制污水条件下运行90 d,通过考察来自反应器的氢气、甲烷产生量的变化,运用Illumina MiSeq 高通量测序方法对反应器中的微生物群落构成进行分析(Analyse),研究四环素对污水厌氧处理系统微生物群落造成的影响,以期从微生物关系角度（angle)深入了解这种影响,为污水厌氧处理技术研究及工程实践提供参考。
1 材料和方法
1. 1 实验装置
ABR 采用厚为5 mm 的有机玻璃板加工制成,尺寸为455 mm × 150 mm × 400 mm,有效容积为21L,置于℃ 的恒温箱中。反应器分为3 个格室,按照前后顺序分为格室1、格室2、格室3,分别命名为C1、C2、C3,每个格室由上、下流室 组成, 折流板底角为45°。格室体积比V1 ∶ V2 ∶ V3 =
1. 5 ∶ 1 ∶ 1。每个格室上部设有集气口,侧部分别设有取水口、取泥口,实验装置见图1。
1. 2 接种污泥
接种污泥取自广州市沥窖污水处理厂A2 / O 工艺的厌氧池。污泥MLSS =
2
4. 67 g?L - 1 ,MLVSS/MLSS = 0. 61,pH =
6. 58,含水率为9
7. 30% 。接种污泥体积为反应器有效容积的1 /3。
1. 3 实验用水
配水以葡萄糖为碳源,NH4 Cl 和KH2 PO4 分别为氮源和磷源,同时加入C
A、M
G、F
E、C
O、Ni 等微量元素,以保证微生物细胞合成的需要。此外,向配水中投加一定量的NaHCO3 以保证ABR 内的缓冲能力。
反应器以连续流方式进水,水力停留时间为24 h。在启动阶段,采用逐步增加进水负荷的启动方式,进水COD 浓度为500 ~ 2 000 mg?L - 1 ,当COD 去除率稳定在80% 以上、出水各项指标趋于正常,启动阶段完成。反应器的运行先后经历了启动阶段、稳定运行阶段、添加四环素运行阶段。
1. 4 DNA 的提取和PCR 扩增及其微生物多样性数据分析
分别在反应器的稳定运行阶段和添加四环素运行阶段每间隔18 d 从每个格室采集一次活性污泥样本,分别命名为Ctrl D18C1、Ctrl D36C1、Ctrl D54C1、Ctrl D72C1、Ctrl D90C1、Tre D18C1、Tre D36C1、TreD54C1、Tre D72C1、Tre D90C1,其中“Ctrl”代表未添加四环素运行时的污泥样本,“Tre”代表添加四环素运行时的污泥样本,“D18”代表第18 天取样,“C1”代表样本取自格室1,格室2 和格室3 的样本命名为C2和C3。实验共从3 个格室中共采集到30 个活性污泥样本。分别称取0. 4 g 污泥用于DNA 提取。采用MOBIO PowerSoil DNA Isolation Kit DNA 提取试剂盒进行DNA 提取,提取步骤依据(yī jù)说明书操作,提取好的DNA 保存于- 20 ℃ 冰箱。
以提取的基因组DNA 作为模板,使用16S rRNA 基因V4 区特异性引物F515 和R806 进行PCR 扩增,扩增片段长度约为300 bp。本实验采用50 μL 的PCR 反应体系:1 μL 模板,各1 μL 的10 μmol?L - 1正向引物和反向引物,0. 2 μL 20 mg?mL - 1 的蛋白质,25 μL 的GOOGLE PRemix Ex Taq Version,
2
1. 8 μL 灭菌水。PCR 的反应条件:94 ℃ 5 min;94 ℃30 s,52 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,31 个循环;72 ℃ 10 min。将各样品的PCR 产物按照等摩尔量进行混合,使用QIAquick Gel Extraction Kit 凝胶回收试剂盒切胶回收PCR 混合产物,并用1% 的琼脂糖凝胶电泳检测,最后使用Illumina MiSeq 高通量测序平台进行基因测序。
测序结束后,首先,使用Trimmomatic 软件去掉序列3′端连续的低质量碱基。接着,用Mothur 中的“make. contigs”命令将两端reads 拼接成完整的目的DNA 片段,再用“screen. seqs”,“trim. seqs” 命令进行错误序列的识别和修剪。最后,使用QIIME 软件对测序数据进行微生物的多样性分析,将得到的序列进行聚类,将97% 相似性的序列聚类成为OTUs 。物种分类由UCLUST 软件 和Greengenes OTU 数据库 实现。
1. 5 反应器气体产生的分析
于固定时间每6 d 测定一次格室内产生气体中氢气和甲烷的含量,检测方法为气相色谱法。使用仪器为安捷伦7820A 气相色谱仪,检测器为TCD,色谱柱为TDX-01,色谱条件如下:进样口、色谱柱、检测器的温度分别为100、100 和200 ℃ ;载气为氮气,流量为35 mL?min - 1 ;进样量为1 mL。
2 结果和分析
2. 1 四环素对反应器内气体产生的影响
ABR 3 个格室中氢气的产生情况如图2 所示。仅在格室1 中检测到氢气的存在,而格室2 和格室3中没有检测到氢气的产生,这主要是由于格室1 进行的是产氢产乙酸反应,而后端格室主要进行的是产甲烷反应。未添加四环素运行时,格室1 内氢气的平均产量为0. 010 2 L? - 1 。添加四环素后,氢气产量是未添加四环素时氢气产量平均值的
4. 05 ~
6. 89 倍。说明四环素的添加能使氢气产量增加。
ABR 3 个格室甲烷产生情况,如图3 所示。在未添加四环素时,格室1、格室2、格室3 的甲烷平均产量分别为0. 320
4、0. 146
2、0. 088 1 L? - 1。显然,甲烷产量在纵向上呈降低的趋势。这与反应器内的底物分配有关,格室1 进水有机物含量较高,随着格室内微生物的降解作用,有机物含量在纵向上随着格室逐渐降低,有机物的减少使得甲烷产量在格室间纵向减小。添加四环素后,格室1、格室2、格室3 的甲烷产量随着运行时间的推移呈现不同程度的下降,分别是未添加四环素时对应甲烷平均产量的4
3. 90% ~ 80. 20% 、
2
7. 18%~ 7
9. 79% 、3
8. 24% ~ 8
3. 70% 。通过对比四环素添加后同一个格室不同时间的甲烷产量变化,发现甲烷产量随着运行时间的推移呈现下降趋势（trend),说明四环素对产甲烷的抑制作用随着时间的推移增大。
2. 2 微生物(Micro-Organism)丰度分析
通过反应器中获取的DNA 序列与GreengenesOTU 数据库进行比对,得出反应器中微生物主要有16 个属,如图4 所示。分别为甲烷杆菌属、密螺旋体属、寡养单胞菌属、不动杆菌属、脱硫弧菌属、长绳菌属、丛毛单胞菌属、互营杆菌属、梭菌属、浮霉状菌属、Blvii28、Paludibacte
R、AUTHM297、WCHB1-05、A17、W22。
由图4 可知,随着四环素的添加,不同物种呈现出不同的变化趋势。其中,随着四环素的添加,密螺旋体属、脱硫弧菌属、互营杆菌属、W22 的丰度在3 个格室内均呈现增长的趋势,说明密螺旋体属、互营杆菌属、脱硫弧菌属、W22 对四环素具有一定耐药性。
密螺旋体属能利用氢气和二氧化碳(C)转化成乙酸。膜生物反应器膜分离技术与生物处理技术有机结合之新型态废水处理系统。以膜组件取代传统生物处理技术末端二沉池，在生物反应器中保持高活性污泥浓度，提高生物处理有机负荷，从而减少污水处理设施占地面积，并通过保持低污泥负荷减少剩余污泥量。主要利用沉浸于好氧生物池内之膜分离设备截留槽内的活性污泥与大分子有机物。膜生物反应器系统内活性污泥（MLSS）浓度可提升至8000~10,000mg/L，甚至更高；污泥龄(SRT)可延长至30天以上。添加四环素后,如表1 所示,格室1、格室2、格室3 内的密螺旋体属分别是未添加四环素时相应密螺旋体属平均丰度的
1. 09 ~
2. 00 倍、
1. 27 ~
1. 79 倍、
1. 41 ~
6. 52 倍,密螺旋体属丰度的增加说明四环素的添加能促进氢气和二氧化碳转化成乙酸的过程,有利于乙酸的积累。有研究表明,乙酸是微生物燃料电池生产电能的首选底物,1 t 生物质可产出价值150 美元的乙酸,却只能产出31 美元的甲烷;因此,在处理四环素污水时,可以充分利用密螺旋体属的优势,增加乙酸积累,可以通过耦合系统将乙酸转化为微生物燃料电池能源或作为发酵工业的原料,实现资源回收。
互营杆菌属是一类产氢产乙酸细菌,能将高级脂肪酸和醇类氧化分解为乙酸和H2 。
添加四环素后,如表1 所示,除了格室1 第18 天和格室3 第54 天的互营杆菌（fungus)属比未添加四环素时平均丰度低,这可能（maybe)是由于反应器运行过程中其他条件扰动引起的,其他时间内格室1、格室2、格室3 内的互营杆菌属分别是未添加四环素时相应互营杆菌属平均丰度的
1. 37 ~
2. 04 倍、
1. 00 ~
3. 95 倍、
1. 48 ~
2. 98 倍,互营杆菌属丰度的增加说明四环素的添加有利于产氢过程,与
2. 1 中氢气产量增大的结论相印证。氢气是一种清洁能源,具有燃烧热值高、燃烧产物无污染的特点,具有很好的应用价值;因此,在处理四环素污水时,可以加强氢气的回收利用,减小污水处理成本。
脱硫弧菌属是一类硫酸盐还原菌,它能利用金属表面的有机物作为碳源,将硫酸盐还原成硫化氢,加速金属管材的腐蚀。添加四环素后,如表1 所示,格室1、格室2、格室3 内的脱硫弧菌属分别是未添加四环素时相应脱硫弧菌属平均丰度的
1. 09 ~
3. 99 倍、
1. 12 ~
3. 59 倍、
1. 20 ~
7. 40 倍,脱硫弧菌属丰度的增加说明四环素的出现会加剧污水处理系统中金属管材的腐蚀;因此,在处理四环素污水时,应充分重视处理系统中金属管材的防腐措施,减少因脱硫弧菌属增多而造成的损失。
格室1 内的寡养单胞菌（fungus)属和不动杆菌属、格室3 内的梭菌属和甲烷杆菌属随着四环素的添加,丰度先减小后增加,如表2 所示,在四环素添加初期,这些微生物物种在相应格室内受到的抑制作用较大,随着时间的推移,所受抑制作用减弱,耐药性增加,说明四环素的长期污染能使微生物的耐药性发生改变。
表1 丰度随四环素添加而增大的物种的丰度变化值
表2 丰度随四环素添加先减小后增大的物种的丰度变化值
2. 3 样本的主坐标分析(Analyse) 和聚类分析
主坐标分析能展示各个样本间的差异大小,2 个样本在坐标轴上的距离较近,则表示这2 个样本的物种组成较相似。膜生物反应器膜分离技术与生物处理技术有机结合之新型态废水处理系统。以膜组件取代传统生物处理技术末端二沉池，在生物反应器中保持高活性污泥浓度，提高生物处理有机负荷，从而减少污水处理设施占地面积，并通过保持低污泥负荷减少剩余污泥量。主要利用沉浸于好氧生物池内之膜分离设备截留槽内的活性污泥与大分子有机物。膜生物反应器系统内活性污泥（MLSS）浓度可提升至8000~10,000mg/L，甚至更高；污泥龄(SRT)可延长至30天以上。图5 反映了未添加四环素时和添加四环素后样本间物种的差异大小。可以看出,主成分1 和主成分2 是造成样品的2 个最大差异特征,贡献率分别为
2
5. 82% 和
11. 86% 。未添加四环素时,C1、C2、C3 的样本分别聚在一起,C1 和C2 样本之间距离较近,且和C3 距离较远,说明未添加四环素时,C1 和C2 的物种相似性较高,且这2 个格室的物种和C3 格室物种有一定差异。添加四环素后,C1 和C3 物种在初期有个渐变的过程,后期3 个格室的样本聚在一起,且与未添加四环素时有一定距离,说明四环素添加前后格室内物种有较大差异,且随着四环素的添加,3 个格室间的物种组成相似性提高。
样品聚类分析图 进一步说明PCoA 的结果,样品越靠近,枝长越短,说明2 个样品的物种组成越相似。由图6 可以看出,未添加四环素时,C1 和C2 格室样品距离较近,枝长较短,说明这2 个格室间物种相似性较高,而C3 格室的样品在另一个分支上,距离较远,枝长较长,说明C3 格室的物种与C1、C2 格室的物种具有一定的差异。随着四环素的添加,C1 和C3 样本在初期有个远离的过程,说明物种有个渐变的过程,在后期3 个格室的样本距离缩短,相互间枝长变短,说明在后期3 个格室物种相似性增大,且添加四环素后的3 个格室样本与未添加四环素时的样本分别位于不同的大分支上,说明四环素的添加使反应器内微生物(Micro-Organism)产生较大变化。
主坐标分析 和样品聚类分析共同说明了四环素添加前后反应器内的微生物(Micro-Organism)的物种组成具有较大差异,四环素添加后,随着运行时间的推移,格室间微生物的物种组成相似性增大。产生这种现象主要原因是:由于四环素耐药物种的存在,使四环素添加后不具有四环素耐药性的物种逐渐被四环素耐药物种取代,随着运行时间的推移,各格室内耐药物种增多,所以格室间物种相似性增大;由于耐药物种逐渐取代了不耐药物种,所以四环素添加前后反应器内微生物物种组成有较大差异。说明长期受抗生素污染的污水处理系统对微生物具有选择性,使微生物群落结构发生变化,进一步说明通过污泥驯化能减小抗生素对污水处理系统的不利影响。具体参见污水宝商城资料或
3 结论
本实验采用实验室人工配置污水,对具有3 个格室的ABR 进行连续流实验,启动反应器达到稳定状态后, 分别在无四环素配置污水和浓度为250μg?L - 1 的四环配置污水环境下运行反应器90 d,探讨2 种条件下氢气、甲烷产量的变化,并运用Illumina MiSeq 高通量测序方法从微观上揭示上述变化的原因。膜生物反应器在污水处理，水资源再利用领域，MBR又称膜生物反应器（Membrane Bio-Reactor ）,是一种由膜分离单元与生物处理单元相结合的新型水处理技术。主要研究结果如下:1) 四环素的添加能使氢气产量增加,四环素对产甲烷的抑制作用随着时间的推移增大;2)Illumina MiSeq 测序获得反应器内的序列所属16 个属,其中,密螺旋体属、脱硫弧菌属、互营杆菌属、W22 对四环素具有一定耐药性;3)格室1 内的寡养单胞菌属和不动杆菌属、格室3 内的梭菌属和甲烷杆菌属对四环素的耐药性随着四环素污染时间的推移,耐药性增加,说明四环素长期的污染能引起微生物的耐药性发生改变;在处理(chǔ lǐ)四环素污水时,可以通过以下调控趋利避害:充分利用密螺旋体属的优势,增加乙酸积累,可以通过耦合系统将乙酸转化为微生物燃料电池能源或作为发酵工业的原料,实现资源回收,在处理四环素污水时,可以加强氢气的回收利用,减小污水处理成本;硫弧菌属增多会加剧污水处理系统中金属管材的腐蚀,因此应充分重视处理系统中金属管材的防腐措施,减少因脱硫弧菌属增多而造成的损失;4)PCoA 分析和聚类分析结果表明,四环素添加前后系统内物种组成具有较大差异,四环素的添加引起了具有四环素耐药性物种逐渐取代不具
