H、NO2--
N、NO3--N等的过程; 好氧反硝化是指微生物在有氧气和碳源存在的条件下, 利用氧气和NO2--N或NO3--N作为电子受体的呼吸作用, 这与反硝化作用只能在缺氧或厌氧条件下进行这一传统观点不同, 也使NH4+-N在好氧条件下直接转化为气体即同步硝化反硝化作用成为可能（maybe).
迄今为止关于异养硝化-好氧反硝化菌的报道大多数都将重点放在菌株的最适生长条件如温度、p
H、C/N上, 或将异养硝化作用和好氧反硝化作用分开研究; 而将二者同时研究或与缺氧反硝化相比较的报道较少.本实验从缺氧污泥中筛选出1株具有异养硝化-好氧反硝化和厌氧反硝化功能的菌株进行鉴定, 并深入探究了其脱氮性能, 以期为异养硝化-好氧反硝化脱氮技术及其在污水生物处理工程中的应用提供理论支持.
1 材料(Material)与方法 1.1 培养基
基础培养液：NaCl 1.0, MgCl2?6H2O 0.5, KH2PO4 0.2, KCl 0.3, CaCl2?2H2O 0.015, TES 2.292, Na2S?9H2O 0.012, N千毫安CO3 2.52.微量元素溶液1 mL, Se/W溶液1 mL, Vitamin溶液5 mL.其中微量元素溶液：HCl10 mL, FeCl2?4H2O 1.5, CoCl2?6H2O 0.19, MnCl2?4H2O 0.1, ZnCl2 0.07, H3BO3 0.006, Na2MoO4?2H2O 0.036, NiCl2?6H2O 0.024, CuCl2?2H2O 0.002; Se/W溶液: Na2SeO3?5H2O 0.006, Na2WO4?2H2O 0.008, NaOH 0.
5. Vitamin溶液：维生素H 0.02, 维生素B 0.02, 维生素B6 0.10, 维生素B2 0.05, 维生素B1 0.05, 维生素B3 0.05, 维生素B5 0.05, 对氨基苯（化学式：C6H6） 甲酸0.05, 硫辛酸0.05, 维生素B12 0.001.碳源和氮源根据实验要求进行调整, 如表 1所示.
表 1 不同培养基中碳源、氮源投加量/mmol?L-1
菌株分离固体培养基：基础培养液10 mL, 0.3 g?L-1 NH4Cl, 琼脂5 g.
1.2 分析(Analyse)方法
NH4+-
N、NO2--
N、NO3--N浓度采用美国DIONEX IC S-2000离子色谱仪进行定量分析, 离子交换柱为Dionex IonPac AS18-4 μm, 柱温30℃, 流速1.0 mL?min-1; 葡萄糖浓度采用美国Agilent公司HPLC 1260 Inifinty高效液相色谱仪进行定量分析, 所用色谱柱为BIO-RAD Amenix HP 76X, RID检测器, 柱温80℃, 流速0.8 mL?min-1; 菌体生长用DNA浓度表示, 用美国Thermo公司Nanodrop Spectrophotometer 1000分光光度计测量.
1.3 菌株的分离和鉴定
菌株的分离：取1 mL缺氧反应器中的污泥样品加入至装有45 mL基础培养液的血清瓶内, 并加入6 mmol?L-1 NaNO3和15 mmol?L-1琥珀酸钠制成筛选培养液, 使目的菌群逐渐成为优势菌群.当筛选培养液中NO3--N降为0时, 取5 mL菌液到新的筛选培养液中, 如此重复5个周期. 5个周期后取1 mL菌液从10-1~10-7进行梯度稀释, 分别注入琼脂待凝固的分离固体培养基中, 缓慢摇匀至琼脂凝固, 约一星期后生长出若干单一菌落.用经灭菌后的注射器将单一菌落从培养基中吸出, 经数次梯度稀释后得到纯菌株.
生态学鉴定：对菌体进行革兰氏染色, 在NIKON ECLIPSE E200显微镜下观察染色结果并拍照; 以及通过Hitachi S-4300扫描电子显微镜拍摄照片来观察菌株DK1的形态.
分子生物学鉴定：菌株DNA提取方法参照QIAGEN公司DNeasy Blood & Tissue试剂盒, 16S rDNA的PCR扩增采用细菌通用引物. PCR反应体系为100 μL, 即DNA模板3 μL, 10×buffer 20 μL, BSA 1.34 μL, MgCl2 12 μL, dNTP混合物2 μL, 正向引物 2 μL, 反向引物 2 μL, Taq DNA聚合酶0.5 μL, 无菌水57.16 μL. PCR反应条件为: 95℃预变性130 s, 95℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸90 s, 进行30个循环, 72℃延伸6 min.将获得的PCR产物参照QIAGEN公司PCR Purification试剂盒中的方法纯化后交由1st base公司进行测序.
1.4 脱氮特性研究 1.4.1 菌株DK1在好氧条件下的脱氮特性研究
实验在160 mL血清瓶中进行, 瓶中加入45 mL基础培养液, 4 mL经活化后的菌液及相应浓度氮源和C/N量比为5葡萄糖.为保证瓶中空气与外界气体的交换, 用经高压灭菌后的锡纸将血清瓶封口, 在32℃、140 r?min-1恒温摇床中培养30 h, 通过每3 h测定NH4+-
N、NO2--
N、NO3--N及葡萄糖和DNA的浓度变化来考察菌株的脱氮能力, 每个实验做3个平行样品.
1.4.2 菌株DK1的缺氧(hypoxia)反硝化特性研究
实验在60 mL血清瓶中进行, 瓶中加入36 mL基础培养液, 3 mL经活化后的菌液及相应浓度氮源和葡萄糖.在32℃、140 r?min-1恒温摇床中培养.为避免O2对实验结果的影响, 基础培养液的制备时在曝N2的条件下煮沸以去除O2并冷却至室温后注入充满N2的血清瓶中, 用丁基橡胶塞和铝盖密封, 高压灭菌20 min.通过测定NH4+-
N、NO2--
N、NO3--N及葡萄糖浓度变化来考察菌株的反硝化能力, 每个实验做3个平行样品.
2 结果与讨论 2.1 DK1的形态（pattern)学特征及鉴定
以琥珀酸钠为氮源的固体培养基, 菌株DK1呈白色球状颗粒.经革兰氏染色通过显微镜观察如图 1左所示, 鉴定其为革兰氏阴性菌; 通过扫描电镜如图 1观察到菌体为杆状, 大小约为2 μm×0.4 μm, 无鞭毛和芽孢.
图 1
图 1 菌株DK1的形态特征
对菌株DK1测序获得长度为1390bp的部分16S rRNA基因序列, 菌株的GenBank的登录号：KY910428, 将所得的菌株序列提交至GenBank中通过BLAST检索, 应用MEGA7软件, 以Neighbor-Joining法绘制系统发育树, 结果如图 2所示, 菌株DK1与Pseudomonas sp.在同一分支, 同源性达99%.可基本确定菌株DK1属于假单胞菌属, 将其命名为DK1.
图 2
图 2 基于16S rRNA序列同源性构建菌株DK1与其他相关好氧反硝化菌的系统发育树
2.2 菌（fungus)株DK1的好氧反硝化特性
菌株DK1在以NaNO3为氮源反硝化过程如图 3所示.从中可看出, NO3--N的初始浓度为87.07mg?L-1, 在0~9 h下降速率较为缓慢, 从9~12 h起下降速率逐渐加快, 在15~21 h间尤为明显, 并在21 h时降为0, NO3--N在21 h内平均去除速率达到4.09mg?-1, 远快于文献中菌株的反硝化速率.结合DNA变化曲线可认为菌株DK1的对数生长期为12~18 h, 并主要在这一时期以NO3--N为唯一氮源发生反硝化过程.但从15 h开始, 随着NO3--N逐渐降低（reduce)至0, NO2--N也开始有了较为明显的积累现象, 在21 h左右达到了最大值28.30 mg?L-1, 而后又逐渐下降, 在30 h降至15.68 mg?L-1.这与肖继波等[13]的几乎无NO2--N的积累现象研究结果不同.本组实验在30 h时NO2--N并没有完全被去除, 但DK1在以NaNO2为氮源的培养基中反硝化效果较好, 如图 4所示, NO2--N的初始浓度为92.90mg?L-1, 经过0~9 h的生长适应期, NO2--N在9 h后迅速下降并在21 h时降为0, NO2--N去除率为100%, 平均去除速率达到4.43 mg?-1, 较连红民等[14]研究的Pseudomonas sp. HN和Zhang等[15]研究的Bacillus methylotrophicus L7的菌速率快; 期间未检测到NO3--N和NH4+-N.
图 3
图 3 菌株DK1在以NO3--N为唯一氮源的好氧反硝化特性
图 4
图 4 菌株DK1在以NO2--N为唯一氮源的好氧反硝化特性
从葡萄糖变化曲线可知, 两组反硝化过程消耗葡萄糖的速率基本相等, 均约为20.02 mg?-1; 第一组菌株的21 h平均生长速率1.08 μg? -1略高于第二组的0.83 μg? -1.在30 h第一组NO2--N还未降为0的原因可能是由于葡萄糖在NO3--N还原为NO2--N时已被大量消耗, 剩余浓度较低以致菌体难以快速生长并利用NO2--N进行反硝化.为证明这一推测, 在12 d后向第一组后的血清瓶中添加6 mmol?L-1的葡萄糖, 继续监测NO2--N浓度变化, 约经15 h后, NO2--N降为0, 假设成立.
表 2 补加葡萄糖后各组氮素浓度变化表/mg?L-1
菌株DK1以NO2--N和NO3--N为氮源的好氧反硝化特性如图 5所示.其中NO3--N的下降与图 3相似, 在初始浓度为85.35 mg?L-1时21 h内降解完全; 但NO2--N浓度从初始的94.95 mg?L-1在18 h前始终在上升, 在18 h时达到最大值109.21 mg?L-1后又迅速下降, 在24 h降为0.而DNA浓度在24 h前较稳定（解释:稳固安定；没有变动)增长, 在NO2--N和NO3--N均降为0后略有下降, 可能是缺乏氮源所致; 24 h的平均生长速率0.75 μg? -1, 略低于前两组, 可能是由于NO2--N在前18 h的积累对菌株生长有一定的抑制作用; 葡萄糖在30 h内的平均消耗速率为46.22 mg?-1, 远大于前两组只加一种氮源的实验.此外, 可知在培养基的初始底物同时含有NO2--N和NO3--N两种氮源的条件下, 菌株DK1会优先利用NO3--N.以上实验说明菌株DK1均可利用NO2--N和NO3--N进行代谢, 与周迎芹等[16]的实验结果一致.
图 5
图 5 菌株DK1在以NO2--N和NO3--N为氮源的好氧反硝化特性
2.3 菌株DK1的异养硝化特性
为了考察菌株DK1是否具有异养硝化性能, 将活化后的菌株接种到以NH4Cl为唯一氮源的硝化培养基中进行培养, 结果如图 6所示. NH4+-N在0~12 h内下降缓慢, 从96.14 mg?L-1只降至91.24 mg?L-1, 但12 h后去除速率明显加快, 从12~21 h期间从91.23 mg?L-1降至约45.63 mg?L-1, NH4+-N去除率为49.98%, 21 h的平均去除速率为2.32 mg?-1, 与文献[9][0.67 mg?-1]和文献[17] [1.38 mg?-1]的菌属相比较快. NH4+-N的下降与菌株的DNA浓度曲线也基本吻合, 即前12 h为生长迟缓期, 12~18 h为生长对数期, 18 h的平均生长速率为2.17 μg? -1.从21 h后, NH4+-N一直维持在48.00 mg?L-1左右不再下降, 葡萄糖也在24 h后停止下降, 平均消耗速率为25.83 mg?-1, 较单一氮源反硝化的消耗速率稍快; 推测不再下降原因仍可能（maybe)是碳源浓度较低, 菌体难以继续生长.而12 d后再向血清瓶中添加6mmol?L-1的葡萄糖, NH4+-N在20 h后降为0, 这一现象与好氧反硝化组的结果一致.
图 6
图 6 菌株DK1在以NH4+-N为唯一氮源的异养硝化特性
整个实验过程中几乎没有检测(检查并测试)到NO2--N和NO3--N.这可能是因为NH4+-N是在氨单加氧酶作用下氧化为羟胺再经羟胺氧化酶作用将其氧化直接转化为N2O和N2等气体并排出[18].这比较符合Richardson等[19]的异养硝化脱氮模型.造成这种现象的原因可能是菌体在长期对外界特殊环境进行调整和适应的过程中, 逐渐形成的优先选择氮素转化过程中最便捷的代谢方式; 还可能是由于菌株其较高的反硝化活性将硝化产生的中间产物立即利用所以检测不到NO2--N和NO3--N的存在[20].结合2.3节中菌株DK1的两组高效反硝化速率, 均大于本组实验中的硝化速率, 分析后者的可能性较大. NH4+-N和碳源同时去除是异养硝化异于自养硝化最明显的特征[21], 所以综上, 菌株DK1可以进行异养硝化及同步硝化反硝化.
2.4 同步硝化反硝化特性
为了研究（research)在不同培养条件下同步硝化反硝化效果, 实验采取将菌株接入含有NH4+-N和NO2--N的培养基 中、含NH4+-N和NO3--N的培养基 中以及含NH4+-
N、NO2--N和NO3--N的培养基 中观察脱氮效果.每隔3h取样测定NH4+-
N、NO2--
N、NO3--
N、葡萄糖及DNA浓度, S1~S3组的结果见图 7~9.
图 7
图 7 菌株DK1在以NH4+-N和NO2--N为氮源的同步硝化反硝化特性
图 8
图 8 菌株DK1在以NH4+-N和NO3--N为氮源的同步硝化反硝化特性
图 9
图 9 菌株DK1在以NH4+-N, NO2--N和NO3--N为氮源的同步硝化反硝化特性
在3组实验中, S1组的NH4+-N和NO2--N及S2、S3组的NH4+-N和NO3--N在前12 h的下降速率较缓慢且相近, 但S1组在15 h后NO2--N下降速率加快, 在21h已经降为0, 平均下降速率为4.31 mg?-1; S2、S3组培养基在12 h后NO3--N下降速率加快, 在18h时即降为0, 平均下降速率为4.75 mg?-1和4.72 mg?-
1. S2、S3组的反应过程中均伴随NO2--N积累且在15 h时达到最大值, 但随即下降并在21 h时降为0.可以看出, 与好氧反硝化特性的实验结果一致, 若培养基的初始底物同时含有NO2--N和NO3--N两种氮源, 菌株DK1会优先利用NO3--N. Kim等的实验表明当NH4+-N和NO2--N两种氮源同时存在时, 菌株会优先选择NO2--N进行反硝化; 而赵丹等[23]的菌株ZD8在此条件下NH4+-N的存在对NO2--N的反硝化有抑制, 菌株会利用NH4+-N先发生硝化作用.本实验结果与此二者均不同, 菌株DK1可同时将二者降解; 张培玉等[24]的实验表明NO2--N的加入不但没有抑制异养硝化作用, 反而加速了NH4+-N的降解, 而本实验结果于此也不同, NO2--N的加入对异养硝化作用几乎无影响, NH4+-N的降解速率与不加NO2--N时几乎相等.
而S1、S2组的NH4+-N下降速率在12 h后虽然较前有所加快, 但始终低于该组中NO2--N或NO3--N的下降速率, 且在27 h后停止下降, 前27 h的平均下降速率为3.04 mg?-1和3.12mg?-1, 远高于He等[25]研究的菌; 而S3组的NH4+-N在30 h时降为0, 30 h的平均下降速率为3.18mg?-1.
S1、S2组前30 h和S3组前27 h的葡萄糖消耗速率与DNA生长速率趋势基本相符; S3组的DNA浓度在27 h后开始下降, 可能原因是氮源已基本耗尽.同异养硝化和好氧反硝化两部分实验的方法, 12 d后再向血清瓶中添加葡萄糖, NH4+-N在11 h后也降为0.比较S1、S2两组培养基的脱氮效果, NO2--
N、NO3--N去除率均达100%, NH4+-N去除率也相近, 分别为90.30%和89.65%, 可知这两组系统脱氮效果基本相同.在C/N量比为5的条件下, S3组系统的脱氮效率最高, 30 h内3种氮源均达到了100%, 高于王骁静等[26]的研究结果.
2.5 菌株DK1的缺氧反硝化特性
由图 10可知, 与好氧反硝化相似, 菌株DK1在缺氧条件下初始NO3--N浓度为83.75 mg?L-1时也在21 h左右将NO3--N降为0, NO3--N的平均去除速率为3.99 mg?-1, 但在21 h时NO2--N也为0, 脱氮率达100%, 高于好氧条件.由图 11可知在以NO2--N和NO3--N为氮源的缺氧反硝化实验中, 菌株DK1仍优先利用NO3--N进行反硝化并且伴有NO2--N积累现象, 且NO3--N平均去除速率与好氧基本相同, 为4.01 mg?-
1. NO2--N在21 h降为0, 去除速率相比好氧组的24 h仍较高.
图 10
图 10 菌株DK1在以NO3--N为唯一氮源的缺氧(hypoxia)反硝化特性
图 11
图 11 菌株DK1在以NO2--N和NO3--N为氮源的缺氧反硝化特性
但是此缺氧条件下的两组DNA浓度均低于好氧条件, 所以, 从这两组含有NO3--N的缺氧反硝化实验可以推测, O2的存在对于NO3--N反硝化到NO2--N的速率并无太大影响, 但对于NO2--N的反硝化速率和碳源的利用有一定的抑制作用.
2.6 菌株DK1在不同NO2--N浓度下的缺氧反硝化特性
根据DK1在NO3--
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