目前,对腈纶废水的研究主要集中在强化预处理和深度处理等方面[5,6,7].研究表明,采用高级氧(Oxygen)化技术对腈纶聚合废水进行分质强化预处理可以获得较好的处理效果[8,9],以Fenton氧化预处理干法腈纶聚合废水为例,处理后废水COD可由1200 mg ?L-1降至600 mg ?L-1左右,污染负荷和生物毒性大幅降低,废水可生化性明显提高[10].物化预处理虽然可以改善废水的水质和可生物降解性,但处理后的出水仍需进一步的生化处理,以实现废水的达标排放或回用.此外,腈纶废水中高浓度有机氮和氨氮的去除也需要由生化处理过程来完成,这就要求生化处理工艺必须具有比较高的脱氮效能.序批式膜生物反应器是序批式生物反应器与膜分离技术的有机结合[11],不但具有传统SBR工艺简单、 运行维护方便、 抗冲击负荷能力强等优点,而且膜的高效截留作用使反应器维持较高的污泥浓度,能有效提高氮（high-nitrogen）、 磷和有机物的去除效果,具有良好的出水水质[12,13,14,15].
本研究以Fenton氧化预处理后的腈纶聚合废水和丙烯腈废水为研究对象,考察了SBMBR对废水的处理效能,优化了工艺运行条件,并采用PCR-DGGE及克隆技术分析了不同运行阶段反应器内微生物群落结构的动态变化,确定了反应器运行过程中的主导微生物,以期为进一步提高腈纶废水的生化处理效能提供理论参考依据. 1 材料与方法 1.1 试验用水
试验所用的腈纶聚合废水和丙烯腈废水取自东北某石化厂,首先将聚合废水采用Fenton氧化预处理[10],处理后废水平均COD由1091 mg ?L-1降至560 mg ?L-1,BOD5/COD由0.32升高至0.69,然后将预处理后的聚合废水按1 ∶1的比例与丙烯腈废水混合,混合后废水COD为450~600 mg ?L-1,HN+4-N为50~80 mg ?L-1,TN为140~200 mg ?L-1, pH值6.5~8.0.模拟丙烯腈废水采用葡萄糖、 硫酸铵等配制,同时加入适量的微量元素液,其COD为340~470 mg ?L-1,HN+4-N为30~60 mg ?L-1.
1.2 试验装置与运行条件
SBMBR反应器有效容积为30 L,内置3片聚偏氟(fluorine)乙烯平板膜元件,单片有效膜面积为0.1 m2,膜孔径0.1 μm.反应器采用周期运行的方式,通过间歇曝气实现缺氧/好氧的交替运行,曝气量为600 L ?h-1.反应器在进入缺氧阶段后的前5 min内完成进水,在好氧阶段的最后60 min时采用间歇式抽吸出水的方式排水,每个周期出水5.0 L,体积交换比为1 ∶
6. SBMBR的运行采用可编程逻辑控制器自动控制系统来实现,反应器内温度控制在30℃±1℃.接种污泥取自北京某污水处理厂二沉池回流污泥,初始活性污泥浓度约为3000 mg ?L-1.试验装置如图 1所示.
图 1 试验装置示意
反应器采用逐渐增加实际废水比例的方式运行,根据运行条件和进水水质的不同,整个运行期可以分为9个阶段,各阶段污泥样品分别标记为S1~S9.反应器的运行条件见表 1.
表 1 SBMBR不同阶段的运行条件
1.3 分析方法
1.3.1 生化指标
CO
D、 NH+4-
N、 NO-3-
N、 TN均采用标准方法测定[16]; pH值采用pH计测定. 1.3.2 PCR-DGGE
采用离心式DNA快速提取试剂盒提取细菌的总DNA,采用细菌通用引物8F-G
C、 518R对总细菌16S rDNA进行PCR扩增.PCR反应采用50.0 μL的反应体系,其组分包括：5.0 μL的10×PCR buffer,4.0 μL的dNTP Mixture,1.0 μL的引物338F,1.0 μL的引物534R,0.25 μL的TaKaRa rTaq,以及2.5 ng的DNA模板.PCR反应条件如下：94℃预变性10.0 min,94℃变性1.0 min,55℃退火1.0 min,72℃延伸1.5 min,共循环30次,最后在72℃条件下延伸10.0 min. DGGE在D-code系统上进行,聚丙烯酰胺凝胶浓度为8.0%,变性剂浓度梯度范围为30.0%~60.0%,电泳电压为150 V,温度为60℃,在1×TAE缓冲溶液中电泳420 min,然后采用硝酸银进行染色,利用凝胶成像系统进行观察、 拍照. 1.3.3 克隆测序
选择DGGE胶板上含有目的DNA的条带,用灭菌后的手术刀切下并迅速转移至离心管中,用灭菌后的刀片将胶块压碎,加入30.0 μL ddH2O在4℃条件下溶解24 h,在5000 r ?min-1转速下离心5.0 min,取5.0 μL上清液为模板,采用总细菌引物8F-GC和518R进行PCR扩增.扩增产物采用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳,检测回收产物,用QIAquick PCR纯化试剂盒对扩增产物进行纯化,并送至北京宝杰罗生物工程公司进行16S rDNA片段序列测定. 1.3.4 DGGE图谱统计分析
采用Shannon-wiener多样性指数H′表征微生物种群多样性,其计算公式如下[17]：
式中,Pi=ni/N; ni为第i个条带的强度; N为所有条带强度总和. 2 结果与讨论 2.1 膜生物反应器处理效果 2.1.1 连续运行效果
SBMBR不同运行阶段对CO
D、 NH+4-N和TN的去除效果见表 2.在反应器的启动阶段,随着聚合废水比例的逐渐增加,COD平均去除率由第I阶段的95.5%降低到第Ⅳ阶段的87.2%,NH+4-N和TN的平均去除率由第Ⅰ阶段的95.9%、 72.7%分别降至48.8%、 60.0%.NH+4-N出水平均浓度由0.8 mg ?L-1升至17.5 mg ?L-1,这主要是由于废水中的碱度不足,导致硝化反应产生大量的酸,SBMBR反应器内混合液pH值降至6.0以下,使得硝化细菌的活性受到抑制,导致出水NH+4-N浓度升高[18,19].在第Ⅴ和Ⅵ阶段,SBMBR进水仍采用1 ∶1的聚合废水和模拟丙烯腈废水,并向进水中投加0.5 g ?L-1的碳酸氢钠以增加废水的碱度.由表 2可以看出,在第Ⅵ阶段,进水NH+4-N的浓度升至65.3 mg ?L-1,但出水NH+4-N浓度却降至0.9 mg ?L-1左右,NH+4-N平均去除率迅速升高至98.6%,此时COD的去除率仍然保持在86.0%左右.这说明在SBMBR处理腈纶废水的过程中,碱度是限制NH+4-N硝化的最主要的影响因素之一. 从第89 d开始,SBMBR进水完全采用实际废水,聚合废水与丙烯腈废水的比例为1 ∶1.在第Ⅶ阶段,反应器进出水COD平均浓度分别为450.3 mg ?L-1和129.2 mg ?L-1,COD平均去除率由86.3%降至71.1%,但NH+4-N去除率仍保持在97.5%以上.这说明在丙烯腈废水中存在部分难生物降解有机物,导致出水COD略有升高,但SBMBR仍然保持较高的NH+4-N去除效率.根据周期试验的优化结果,从第99d开始,调整每个运行周期内厌氧好氧的时间为90 min和150 min.在第Ⅷ阶段,出水COD和NH+4-N的平均浓度分别为117.3 mg ?L-1和1.7 mg ?L-1,平均去除率分别为71.7%和98.0%,但TN的平均去除率仅为47.4%,这主要是由于进水C/N比过低、 微生物缺乏足够的碳源导致的.在第Ⅸ阶段,往进水中投加葡萄糖增加碳源,进水COD浓度增加至598.2 mg ?L-1,而出水COD浓度则降至105.1 mg ?L-1,NH+4-N浓度则降至1.0 mg ?L-1以下,CO
D、 NH+4-N和TN的平均去除率分别为82.5%、 98.7%和74.6%,出水指标可以达到国家一级排放标准.
表 2 SBMBR在不同运行阶段的主要参数
同传统的活性污泥处理工艺相比,SBMBR系统对废水COD的去除率更高,这主要归于以下两个原因：一方面,长期的厌氧/好氧交替环境驯化出适应腈纶废水特性的微生物种群,这些微生物能够有效利用废水中的有机污染物[20]; 另一方面,SBMBR系统膜分离及膜表面的泥饼有很强的过滤分离能力,能有效滤除废水中悬浮物、 大分子有机物和微生物体[21,22],保证了SBMBR系统优良且稳定的出水水质.此外,反应器运行期间平板式膜组件表现出较强的抗污染能力,在膜通量为16.7 L ?-1,MLSS在6000~6500 mg ?L-1之间,曝气量为10.0 L ?min-1的运行条件下,前60 d跨膜压差基本上保持在7.5 kPa左右,此后开始逐渐升高,第87 d的时候TMP达到27.0 kPa,超过了25.0 kPa的清洗临界值,取出膜组件采用物理清洗后TMP恢复至8.0 kPa左右,在之后运行的40 d时间里,TMP没有出现明显的升高. 2.1.2 周期试验
序批式生物反应器通过间歇曝气的方式在反应器运行中实现缺氧/好氧的交替循环（continue),最终通过硝化/反硝化过程实现有机物和氮的去除,因此,合理的运行周期不仅可以提高生化系统的处理效果,还能降低能耗和运行成本[23].在反应器运行的Ⅰ到Ⅶ阶段,SBMBR的周期运行方式为60 min缺氧/300 min好氧,该条件下单个运行周期内CO
D、 NH+4-
N、 NO-3-N的变化如图 2所示,可以看出,COD的降解和NO-3-N的去除主要发生的缺氧搅拌期,这是因为在缺氧条件下,异养型的反硝化细菌（fungus)以废水中有机物为营养物质,通过反硝化过程实现N的去除[24].此外,在缺氧搅拌过程中,系统中NH+4-N的浓度逐渐升高,这主要是废水中有机氮在微生物作用下向NH+4-N转化导致(cause)的.在好氧阶段,经过约90 min的曝气,NH+4-N浓度迅速降低（reduce)至1.0 mg ?L-1左右,NO-3-N的浓度逐渐升高并在在曝气210 min左右时基本达到最大并稳定.为了提高反应系统对污染物的降解能力,减少过度曝气带来的能耗损失,从第99 d开始,调整SBMBR的运行周期为90 min缺氧/150 min好氧,由图 2可以看出,在该运行条件下,COD和NH+4-N都能够在最经济的条件下得到有效的去除,出水可以稳定达标排放.
图 2 CO
D、NH4+-N和NO3--N浓度在周期试验中的变化
2.2 微生物群落结构分析
2.2.1 总特殊结构：荚膜、鞭毛、菌毛的DGGE图谱
反应器运行各阶段污泥样品总细菌（fungus)的DGGE指纹图谱见图 3.从中可以看出,在反应器连续运行的9个阶段,各阶段污泥样品的电泳条带数目、 条带强度和条带迁移速率均存在一定的差异,SBMBR系统中微生物种群呈现出较为明显的演替变化.在反应器运行的初始阶段,污泥的培养驯化还未完成,污泥样品的条带数目较少,说明微生物种群结构较为简单.随着实际废水比例的不断增加和污泥的驯化,污泥样品的条带数目开始逐渐增多,条带分布也较为均匀,说明微生物种群组成开始变得更加丰富（plump),反应器的稳定性也在不断增强.从S7开始,由于采用了实际丙烯腈废水代替之前的模拟废水,进水水质发生了明显的变化,微生物种群结构也发生了较为明显的变化,部分菌种的条带强度略有降低,并产生了一些新的条带,说明不适应进水水质的微生物群落优势度降低,降解实际废水中污染物的新菌群逐步建立并形成为优势菌种.S9样品泳道中条带较为丰富、 均匀度较好,说明反应器经过一个阶段的运行后,微生物群落逐渐丰富并达到一个稳定的状态.
图 3 SBMBR污泥总细菌的DGGE指纹图谱
采用非加权配对算术平均法对微生物群落结构相似性作聚类分析,结果如图 4所示.从中可以看出,9个样品的微生物群落可以分成3大族群,样品1、 2为一个族群,样品3、
4、 5为一个族群,样品6、
7、
8、 9为一个较大的族群,这说明随着反应器运行条件的不同和进水水质的变化,污泥微生物群落结构发生了一定程度的变化.在完全采用实际废水处理后,污泥样品的群落结构与之前采用部分模拟废水时的群落结构存在较为明显的变化.
图 4 SBMBR中细菌群落结构的聚类分析
2.2.2 总细菌多样性指数
采用Shannon-wiener多样性指数表征总细菌群落结构多样性,结果见图 5.在S1~S4,随着聚合废水比例的逐渐增加,在废水特征污染物的选择作用下,一些不适应聚合废水的微生物生长处于劣势,微生物种群数量减少,生物多样性指数略有下降,而随着新的微生物种群结构的建立和微生物对水质和外部环境的逐渐适应,细菌种类和数量又开始增加,生物多样性指数上升,在S4时达到了一个较高的水平.从S5开始,由于调整了进水碱度和pH,微生物群落结构受到外部环境变化影响,微生物多样性指数出现小幅降低,而在之后的一段时间内,反应器pH值始终维持在7.5~8.5之间,进水的水质也基本趋于稳定,微生物的生长条件比较适宜,新的微生物种群结构逐渐建立,S9的微生物的多样性指数达到了最大.
图 5 SBMBR微生物多样性指数
2.2.3 优势菌种的鉴定
对DGGE指纹图谱的条带进行回收测序分析,将测序结果与NCBI数据库中已知序列进行比对,确定各微生物的同源性及种属,检测到的微生物及其相关信息如表 3所示.经比对鉴定(同义词:判定、判断、判决),在SBMBR的9个污泥样品中共检测到22种微生物,其相似度大多在98%以上,其中属于变形菌Proteobacterium的微生物有12种,分别属于α纲和γ纲,其余10种属于未分类的Bacterium.
在反应器运行不同阶段,DGGE指纹图谱中的条带强度和优势菌种也在不断变化,各菌种的功能也不尽相同.Uncultured bacterium clone S2-42和Uncultured bacterium clone AS_bH9主要与氨氮的硝化过程有关[25]; Klebsiella pneumoniae strain 27F主要与醇类物质的降解过程有关[26]; Uncultured Hyphomicrobiaceae bacterium检出于受石油污染的土壤,与甲苯的降解过程有密切的关系[27].另外,根据GenBank数据库描述,Sphingomonas sp. EMBS051发现于染料废水的生物降解过程中,与废水中大分子芳香族化合物的降解过程有关; Uncultured bacterium clone PAE-49与氨氮的硝化过程有关; Uncultured bacterium clone WT14H7和Uncultured bacterium clone WT14H9发现于吡啶的堆肥降解过程中,可能与腈纶废水中某些类似含氮杂环有机物的降解过程有关.
表 3 SBMBR中优势菌条带测序结果
在处理实际腈纶废水的最后3个阶段,反应器内优势微生物主要有：Uncultured bacterium clone F49 、 Uncultured bacterium clone S2-42 、 Sphingomonas sp. EMBS051 、 Uncultured bacterium clone AS_bH9 、 Uncultured Hyphomicrobiaceae bacterium 、 Uncultured bacterium clone PAE-49 、 Uncultured bacterium clone WT14H7 ,这7种微生物在降解腈纶废水污染物的过程(guò chéng)中起着重要作用,是保证生化处理单元效果和反应器稳定运行的重要保证.然而,这些微生物多为未培养的微生物,且腈纶废水的污染物组成十分复杂,要具体了解这些微生物在反应器中的功能,以及它们与特定污染物降解之间的关系,还需要做更细致、 更深入的研究. 具体参见污水宝商城资料或
3 结论
SBMBR处理Fenton预处理后的腈纶聚合废水和丙烯腈废水,在废水比例为1 ∶1、 HRT为24
H、 缺氧90 min/好氧150 min交替运行条件下,出水COD和NH+4-N浓度分别为105 mg ?L-1和0.9 mg ?L-1,出水水质可以稳定达到国家污水综合排放标准的一级标准.
碱度和碳源不足是限制脱氮效能的主要影响因素,碱度不足影响NH+4-N的硝化反应,碳源不足影响TN的去除效果,增加进水碳源可以显著提高TN的去除效率(efficiency).
PCR-DGGE分析表明,反应器内微生物(Micro-Organism)多样性与进水水质和运行条件密切相关,反应器运行期间微生物群落结构呈现出明显的演替过程(guò chéng),生化系统完全稳定后,微生物多样性指数达到最大.
通过克隆测序，从9个运行阶段的污泥样品中成功鉴定获得22种微生物的16S rDNA序列,并筛选出7种降解腈纶废水的优势微生物,为腈纶废水生化处理的深入研究（research)提供了分子生物学基础资料.
