生物膜(英文：Biofilm)是由附着于惰性或者活性固体材料(Material)表面的微生物(Micro-Organism)和由微生物自身分泌的胞外聚合物所形成的高度结构化微生物群落.它的存在可引起一系列的环境问题, 如膜污染、管道堵塞、金属表面腐蚀和消毒效率降低等.目前对其控制多采用杀菌剂、抗菌剂或其它大分子抑菌剂.但这些物质的释放无疑带来了新的环境风险, 长期使用抗生素或者杀菌剂还会导致细菌的抗药性增加, 耐药细菌蔓延.
利用化学信号小分子物质通过抑制微生物活性, 调节生物膜的发展过程是目前生物膜领域的研究热点.双胺是某些微生物自身产生的可以引起一些生物膜解体的信号分子, 探讨这种小分子物质的生物膜调控作用对于开发新兴生物膜控制技术具有重要意义.目前, 双胺对微生物附着的抑制研究较少且多集中于纯菌生物膜, 对混合菌落生物膜的抑制研究鲜有报道.实际环境中的生物膜多由混合菌群组成, 因此有必要研究双胺对混合菌落生物膜抑制及解聚效应.本研究将以双胺为目标物质, 考察这种小分子物质对混合菌落生物膜形成抑制及解体效应机制, 并进一步对其减缓膜表面生物污染的可行性进行探讨.该研究对于建立基于小分子物质的生物膜抑制及膜表面生物污染控制方法具有理论价值与实际指导意义.
2 材料与方法2.1 化学试剂和微生物
双胺购自美国Sigma-Aldrich公司, 纯度为99%.其他化学试剂购于梦怡美生物科技有限公司.
混合菌落来源于清河污水处理厂的活性污泥, 经过美吉生物医药科技有限公司通过MiSeq系统分析组成主要包括丛毛单胞菌属、孢鱼菌科、肠杆菌科、梭状芽孢杆菌、鞘脂单胞菌属、假单胞菌属、固氮螺菌属、寡养单胞菌和铁杆菌属.活性污泥首先用磷(P)酸盐缓冲溶液冲洗3遍以去除污泥溶液中的EPS及有机物, 然后将活性污泥重悬于合成废水中用于制备混合菌菌悬液.合成废水包含：COD 825;NH4Cl 192;KH2PO4 35.1;NaCl 100;MgSO4 100;CaCl2 10;pH=6.5~7.5.
2.2 双胺对混合菌群生物膜形成影响研究
将含有不同浓度双胺的菌悬液加入到聚苯乙烯的12孔板中, 每孔4 mL, 双胺终浓度分别为0、2.62、6.55、13.10、26.20、65.50或131 mg?L-1, 每个浓度设置6个平行样以确保实验的准确性.将加完样品的12孔板置于30 ℃恒温培养箱中分别静止培养12 h和24 h.培养完成后附着的生物膜量利用结晶紫染色法相对定量.本研究以活性污泥作为生物膜形成的混合菌来源, 随着生物膜的形成和发展, 其群落结构可能会与活性污泥有一些差别, 但本研究重点不是关注其群落结构演变过程, 而是以生物膜形式负载到基底材料表面生物量的变化, 并以其来评价生物膜形成抑制效应.
2.3 不同基底层上双胺对混合菌群附着影响
抑制剂对微生物附着特性的影响和附着基底材料表面特性密切相关, 所以本研究（research)进一步考察了双胺对微生物在不同材质基底层表面的附着影响.分别选择具有不同亲疏水性特性的聚苯乙烯、玻璃片和聚甲基丙烯酸甲酯3种材料为附着界面, 3种表面接触角分别为93.4°、22.0°和81.9°.分别将20 mm× 20 mm玻璃片或聚甲基丙烯酸甲酯片置于6孔板中进行附着实验, 每个孔板中加入6 mL污泥悬液, 再分别加入双胺终浓度为0或131 mg?L-1.污泥悬液、基质浓度及操作条件和上述的附着实验一致.培养24 h后, 将载玻片烘干, 染色并用Olympus相机进行拍照记录.
2.4 双胺对膜污染缓解效应研究
将双胺投加到溶液通过和悬浮微生物作用之后, 微生物在膜表面的附着实验分别以静态附着和动态死端过滤形式考察.静态实验如下：将直径为3.5 cm的膜片置于6孔培养板, 加入10 mL混合菌液, 同时加入双胺使其终浓度分别为0或131 mg?L-1, 30 ℃恒温培养箱中静止培养24 h, 取出膜片放在15 mL PBS中超声使附着的微生物完全掉落后在旋涡混合器中快速混合15 s, 测定特殊结构：荚膜、鞭毛、菌毛OD600值.动态过滤采用恒流过滤模式, 使用一台蠕动泵将储水容器中混合菌液通过管道压入膜组件, 电子天平收集溶液的质量数据, 当膜表面造成一定堵塞之后, 膜压增加, 压力表读数上升.通过压力表读数可间接评价膜污染发展状况.
2.5 双胺对混合菌群生物膜解体影响(influence)研究
为了考察双胺对生物膜的解体性能, 需预先培养生物膜.然后将载玻片拿出洗掉未附着的微生物.然后放置于含有131 mg?L-1双胺的PBS溶液中, 另外的载玻片放入只含有PBS的溶液中作为对照, 30 ℃分别静置6、8、10或12 h后, 将载玻片拿出洗掉悬浮的微生物, 剩余生物量采用如上结晶紫染色法进行相对定量.
2.6 双胺对悬浮微生物EPS分布影响研究
为了探讨双胺对生物膜形成抑制机理, 本研究进一步对悬浮混合菌群微生物的EPS进行考察.具体操作步骤如下：将含有一定浓度的污泥悬液和基质置于50 mL离心管中, 同时加入双胺使其最终浓度分别为0、131 mg?mL-1, 30 ℃放置一定时间, 测定EPS含量变化, 同时测定悬浮液的OD600变化.EPS的提取参考Xuan等的方法, 蛋白测定采用的Lowry法, 多糖的测定采用的是硫酸-苯酚比色法;eDNA的测定参考Allesen-Holm等的方法.
3 结果与讨论3.1 双对混合菌（fungus)群生物膜形成影响
不同浓度双胺对混合菌群微生物附着特性的影响结果如图 1所示.微生物经2.62~131 mg?L-1双胺处理12 h附着量下降了5.61%~67.93%, 处理24 h附着量下降了4.60%~74.61%.可见在选定的两个时间段对微生物附着的抑制作用均随着双胺浓度升高而增强.
图 1
图 1不同浓度双胺对混合菌落生物膜形成影响
3.2 不同基底层上双胺对微生物附着影响(influence)
微生物附着到载体表面是生物膜形成的第一步, 可以通过特异性或者非特异性的特殊结构：荚膜、鞭毛、菌毛-表面相互作用发生.一些表面特性会影响微生物的附着, 且一些抑制剂对微生物附着抑制作用也会受到表面特性的影响.因此, 本研究对于不同基底层上双胺对微生物附着影响特性进行考察.双胺存在的情况(Condition)下, 附着到基底材料的生物量经结晶紫染色记录, 如图 2所示.结果显示无论是在疏水性的聚苯乙烯表面还是亲水性的聚甲基丙烯酸甲酯和玻璃表面, 双胺对微生物的附着均有很好地抑制作用.说明这种物质可以广泛应用于不同材质材料表面生物膜的控制.
图 2
图 2不同基底层表面双胺对微生物附着影响
3.3 双胺对膜污染缓解效应研究
另外, 为了进一步探讨双胺控制膜表面生物污染的可能性, 将双胺投加到溶液通过和悬浮微生物作用之后, 考察微生物在膜表面的附着形态, 分别以静态附着和动态过滤形式考察.静态形式培养条件下, 微生物经过不同浓度的双胺作用后在聚酰胺膜表面的附着量如图 3所示.结果显示, 微生物经过双胺处理在膜表面的附着量明显降低, 而且双胺浓度越高, 附着量越少.例如, 经过26.2、65.5及131.0 mg?L-1双胺处理后, 微生物在膜表面附着量分别降低了18.38%、31.03%和69.15%.双胺显著抑制了微生物在膜表面的附着, 而且这种抑制效果和双胺浓度成正相关.此结果也在SEM中得到证实, 对照组膜表面形成的微生物群落比较致密, 生物膜连成片, 而实验组膜表面附着的微生物相当稀疏, 有大量的空白区域, 实验组膜表面附着的生物量要明显少于对照组膜表面附着的微生物量.
图 3
图 3双胺对混合菌落微生物在聚酰胺膜表面的附着影响
对于生物膜动态过滤培养过程, 膜过滤过程中膜压随过滤液质量及时间变化如图 4所示.由图可以看出, 当过滤重量为359.71 g, 过滤时间170 min时, 对照组膜孔发生了一定程度的堵塞, 此时膜压为10 kPa, 但实验组中的膜压仍然为0, 表明膜孔径并没有像对照组膜堵塞严重;当过滤液质量为628.55 g, 过滤时间为300 min时, 实验组中的膜压力开始上升, 膜压为12.5 kPa, 约为过滤时间175 min时的对照组膜压, 而此时对照组中的膜压已经为50 kPa.这表明双胺可减缓膜过滤过程中膜孔堵塞速度, 降低膜压, 缓解由微生物引起的膜污染问题.
图 4
图 4膜过滤过程膜压随过滤质量和过滤时间变化图
3.4 双胺对混合菌群生物膜解体影响
一些传统的物理化学方法, 如冲刷、消毒剂及紫外线消毒等常被用作生物膜筛除, 但由于生物膜中细菌受EPS的保护作用使其对这些常规方法具有一定抗性, 即使高浓度的杀菌剂也很难将生物膜去除.例如, 500 mg?L-1的常规剥离剂也难以剥离成熟的生物膜, 紫外线对生物膜中微生物杀灭能力明显弱于对悬浮微生物的杀灭作用.本研究进一步对小分子物质双胺能否引起成熟生物膜解体进行探讨.131.0 mg?L-1双胺对于预培养12 h的生物膜解体效果如图 5所示.由图得出, 双胺处理生物膜6~12 h后, 生物膜量相对于对照组下降了3.87%~23.59%, 由此可以说明双胺对生物膜解体有一定的促进作用.这对于控制生物膜, 降低微生物安全风险具有重要的意义.
图 5
图 5双胺对成熟生物膜的解体作用
3.5 双胺对微生物EPS分泌的影响
为了进一步探究双胺对微生物(Micro-Organism)的作用机制, 本研究进一步考察了双胺对微生物生长及其EPS的影响(influence).结果如图 6所示, 131 mg?L-1双胺对微生物12 h生长量的抑制率为0.36%±0.54%, 没有抑制微生物生长;对照组中胞外蛋白、多糖和eDNA的含量分别是 mg?g-1 MLVS
S、 mg?g-1 MLVSS和 μg?g-1 MLVSS, 经过双胺处理之后, 胞外多糖和eDNA均有下降, 分别为 mg?g-1 MLVSS, μg?g-1 MLVSS, 下降了39.37%±2.68%和70.05%±2.93%, 而胞外蛋白含量几乎没有变化, 均保持在8.02~8.98 mg?g-1 MLVSS.本课题组进一步通过激光共聚焦观察及定量计算显示双胺对生物膜处理后使多糖减少了53%.由此可以推断双胺对微生物附着及生物膜形成的抑制作用并不是通过杀菌产生, 对微生物EPS中胞外多糖和eDNA分泌有一定的抑制作用, 但对胞外蛋白没有影响.
图 6
图 6双胺对微生物生长及EPS产量的影响(influence)
据报道, 双胺结构中含有的氨基可以直接和一些带负电荷的基团或者是胞外多糖中一些带有极性基团的糖类相互作用, 这可能（maybe)是其引起二者浓度降低的重要原因.众所周知, EPS对于微生物附着及其生物膜形成起着至关重要的作用, 它促使微生物在生物和非生物表面的初始附着.将EPS完全去除以后, 微生物的附着性能显著降低.胞外多糖是生物膜形成的诱导因子, 可使表面预处理化附着更容易发生, 甚至可以作为特殊结构：荚膜、鞭毛、菌毛碳源;eDNA对于微生物在亲水性和疏水性表面的附着都起着重要的作用, 它通过多种方式调控生物膜的发展过程, 如为其他细菌提供基质、它是生物膜结构的重要成分、可促进基因物质的交换及调控结合性摄取系统等.另外, EPS中的蛋白组大多为带正电荷的疏水性物质、多糖为带负电荷的亲水性物质及eDNA为带负电荷的疏水性物质, 三者之间的相互作用维持了细菌的表面特性, 当这三者组成发生变化时会造成细菌表面特性的变化, 而细菌表面特性和微生物的附着密切相关.所以本研究中双胺通过抑制微生物中EPS某些成分的特性或者分泌, 进而影响微生物附着和生物膜形成, 并且导致一小部分的生物膜可以从EPS的包裹中释放出来解体为悬浮态细菌, 即引起生物膜解体.已有一些报道也发现当EPS中蛋白、多糖和eDNA浓度降低时, 微生物附着量相应下降.
4 结论
1) 双胺能有效抑制混合菌群微生物附着和生物膜形成, 随着浓度的升高抑制作用增强, 且其抑制效果较为稳定, 抑制率不会随着时间延长而降低.
2) 双胺对成熟生物膜解体有一定的促进作用.这对于控制生物膜, 降低微生物安全风险具有重要的意义.
3) 双胺在生物膜形成有效抑制浓度范围内并没有对于微生物生长产生显著作用, 因此不是通过杀菌(sterilization)方式抑制生物膜形成, 而是通过抑制微生物中EPS含量, 可以避免传统杀菌剂产生的抗药性问题(Emerson), 因此为生物膜抑制提供了新方法.
4) 双胺可减缓膜过滤过程中膜孔堵塞速度, 降低膜压, 缓解由微生物引起的膜污染问题, 这对环境中膜污染控制具有潜在的指导意义.
