目前，随着现代工业的不断发展，大量有毒有害废水排入到环境中，苯酚(phenol)作为树脂制造、炼油、制药、焦碳原料等工业过程中的重要工业原料和产生的一种有机污染物，是工业污水中的主要有害物质，会对动、植物产生有毒甚至致命的危害.苯酚对水生生物具有很强的毒害作用，水体中5~25 mg · L-1的浓度即可对鱼类的生存构成威胁.长期饮用被苯酚污染的水或吸入低浓度酚蒸汽或会引起长期累积性中毒，而饮用高浓度酚溶液、吸入高浓度酚蒸汽则将引起急性中毒，尤其对人体神经系统危害较大.美国环保署把苯酚列入129种优先污染物和65种有毒污染物之列，我国也把苯酚列入中国环境优先处理的污染物“黑名单”之中.因此，去除水体中的苯酚等酚类污染物已成为污水处理的重要课题.
降解酚类的方法主要包括吸附法，电化学法和生物降解法等，其中生物降解因投资与运行成本低、二次污染小、处理效率高等优点，因而广泛应用于含酚废水处理.近年来，许多学者在这方面进行了大量的研究，从被酚类物质污染的环境中已分离得到多种降解酚类的微生物菌株，主要有根瘤菌、酵母菌、醋酸钙不动杆菌、假单胞菌、真养产碱菌、反硝化菌、红球菌等.其中，大部分研究主要集中于酵母菌、芽孢杆菌以及假单胞杆菌，对Acinetobacter属的细菌较少报道.生物降解法处理有毒和难降解的工业废水时，一般需要利用生物强化技术来驯化、筛选、诱变和选育高效微生物降解利用有毒有害物质，但工业废水组成成分的动态变化特点易对生物系统造成冲击，使其中的高效降解微生物菌群致死、流失.利用高效降解微生物对苯酚进行生物降解，能有效去除水体中的苯酚，但降解过程的影响因素较多，有必要从诸多影响因素中筛选出最为重要的影响因素，控制生物降解系统能较好的耐受环境冲击并高效运转.由于传统单因素实验不能确定主次因素的差别，而Plackett-Burman实验广泛应用于生物过程重要参数的筛选，通过对实验进行统计学设计和数据分析，筛选出对目标值影响最大的关键因素.响应面分析法是一种优化过程的有效方法，其中的Box-Behnken实验设计法比较常用，可用于确定实验因素及其交互作用在过程中对指标响应值的影响，精确的表述因素与响应值之间的关系.该法与正交设计比较，所需实验组数相对较少，更能直观体现因变量的最佳值.
本研究从株洲某化工厂污水处理车间氧化池的活性污泥中筛选分离出一株能高效降解苯酚的细菌（fungus)菌株YH8，根据其形体特征、生理生化性状、BIOLOG鉴定、16S rDNA和gyrB序列分析进行分类鉴定，研究了该菌株降解苯酚的特性和初步探讨了该菌株降解苯酚的途径，并利用响应面法优化（optimalize）菌株YH8降解苯酚的条件以提高降解效率.
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 样品来源
从株洲市某化工厂废水处理车间氧化池采集的活性污泥作为筛选降解菌株的样品.
2.1.2 培养基
种子培养基:每升含酵母粉5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，pH 7.0~7.2.无机盐培养基:每升含K2HPO4 0.4
G、KH2PO4 0.4
G、NaCl 0.1
G、2SO4 0.04
G、MgSO4 · 7H2O 0.1
G、MnSO4 · H2O 0.01
G、Fe23 · H2O 0.01
G、NaMoO4 · 2H2O 0.01 g，加水定容至1000 mL. 选择培养基:在已灭菌的MS培养基中，按浓度要求加入经0.22 μm微孔滤膜过滤的苯酚母液，pH 7.0.以上固体培养基需加入1.8%的琼脂粉，经121 ℃、20min高压灭菌备用.
2.2 实验方法
2.2.1 菌株的分离纯化
准确称量氧化池活性污泥10 g，加入到装有90 mL三级水的锥形瓶中，30 ℃、200 r · min-1恒温摇床中振荡培养1 h.将重悬液按2%接种量加入到含苯酚的选择培养基中，苯酚浓度按100、200、500、1000、1200、1500、2000 mg · L-1依次提高以梯度驯化与富集降解菌.经过多次转接培养，梯度稀释培养液并涂布于含苯酚固体选择培养基上，在30 ℃恒温培养箱中倒置培养12 h.挑取菌落形态不同的单菌落接种至LB平板上，反复划线分离纯化得到纯菌株，保存于4 ℃冰箱中备用.
2.2.2 降解菌的筛选
将保藏的纯化菌株接种至LB平板上，划线分离单菌落.挑取单菌落接种到LB液体培养基中，30 ℃、200 r · min-1振荡培养至OD600为2.0.连续活化3代后，用生理盐水将发酵液离心洗涤2次并重悬菌体.以2%接种量接种至选择培养基中，振荡培养并间隔12 h检测培养液中苯酚含量，从中挑选降解苯酚能力最强的菌株.
2.2.3 形态特征鉴定
肉眼观察降解菌的菌落形状、大小、颜色、透明度、粘稠度、湿润度、隆起和边缘特征及是否产色素等，菌体染色后用高倍显微镜观察菌体革兰氏染色、鞭毛、荚膜、芽孢等结构，利用日立S-3400N型扫描电镜观察菌体大小和表面结构.
2.2.4 生理生化特性测定
参照文献进行生理生化鉴定，另采用BIOLOG全自动鉴定仪比对代谢指纹进行鉴定.采用添加5 μg · mL-1的抗生素，浓度梯度为50、100、400、500、800、1000、1200、1500、2000 mg · L-1的重金属盐的LB培养基培养YH8，检测菌株的相关抗性.
2.2.5 16S
rDNA基因序列的测定及分子系统发育树的构建 细菌基因组DNA采用EasyPure Genomic DNA Kit试剂盒，依据说明书提取.16S rDNA基因序列的获取参照文献.PCR产物经琼脂糖电泳检测纯化，送生工进行双向测序并拼接输出全序列，16S rDNA序列用BLAST进行相似性搜索和同源性比对，采用ClustalX 1.8进行序列匹配分析，通过MEGA6.0软件使用邻接法构建系统发育树，利用Bootstrap检验各分支的置信度.
2.2.6 gyrB基因序列的测定及分子系统发育树的构建
gyrB基因是普遍存在于细菌中编码促旋酶B亚单位的基因，该基因进化速率快，每100万年的平均碱基替换率为0.7%~0.8%，gyrB基因弥补了非蛋白编码基因16S rDNA无法区分近源种的缺陷.以提取的细菌基因组DNA为模板，采用gyrB的保守引物对UP-1F/UP-2R进行PCR扩增，PCR反应体系及反应步骤参照文献.利用测序引物UP-1S:5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA-3′和UP-2sr: 5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC-3′双向测序并连接，gyrB序列构建系统发育树的方法同上.
2.3 优化降解条件
经单因素实验确定影响YH8降解苯酚的环境因素.以苯酚降解率为响应值，采用三步法进行苯酚降解的优化.首先，利用Plackett-Burman设计选出对菌株降解苯酚效率影响较大的因素，然后利用最陡爬坡设计逼近最佳区域，最后利用响应曲面法中的Box-Benhnken设计进行实验.通过实验数据拟合响应面模型，最终确定最优降解条件并进行验证.实验数据借助SPSS和Design Expert软件进行分析.
2.4 苯酚降解机理的研究
2.4.1 细胞粗酶液的提取
将筛选到的菌株YH8接种至选择培养基和LB培养基中，30 ℃、200 r · min-1振荡培养32h，取对数生长期末期菌液50 mL，4 ℃、12000 r · min-1离心10 min，上清液即为胞外粗酶液，于-20 ℃冻存.菌体沉淀用pH 7.0的磷酸缓冲液清洗两次后，重悬于磷酸缓冲液中.在冰浴中，用HUP-400A型超声波细胞破碎仪破碎细胞，超声破碎30 s，间隔30 s，连续处理10 min.于4 ℃、13000 r · min-1离心20 min，上清液即为胞内粗酶液，于-20 ℃冻存.
2.4.2 菌株降解苯酚相关基因的PCR扩增
以细菌（fungus)基因组DNA为模板，扩增苯酚羟化酶、邻苯二酚2，3-双加氧酶和邻苯二酚1，2-双加氧酶基因片段.LmPH引物为Lph:5′-AGGCATCAAGATCACCGACTG-3′;Lph
2:5′-CGCCAGAACCATTTATCGATC-3′. C23O引物为C23OF:5′-GGTCTGATYGAAATGGAYCGCGA-3′;C23OR:5′-CGTTCGTTSAGCACCCGGTCGTG-3′. C12O引物为C12OF:5′-CCTGARCBGTHGGYTTT GCNCGTATGGATGA-3′;C12OR: 5′-TCACGRGTW GCRWARGCAAAGTC-3′.上述基因片段扩增体系与16S rDNA基因序列扩增体系相同，LmPH引物的PCR反应程序为:94 ℃预变性5min;94 ℃变性30s，52 ℃退火30s，72 ℃延伸1min，30个循环;72 ℃延伸10min.C12O和C23O的引物的PCR反应程序为:94 ℃预变性3min;94 ℃变性30s，59 ℃退火30s，72 ℃延伸1min，30个循环;72 ℃延伸10min.PCR产物经琼脂糖电泳检测、纯化、测序，测序结果用BLAST软件与Genbank数据库中已收录的基因序列进行同源性比对.
2.4.3 质粒的检测与消除
采用碱裂解法抽提质粒.质粒消除采用变温-SDS法.采用点接法将单菌落按相同位置接种至LB和选择培养基的平板上，对能在LB平板上生长而不能在选择培养基上生长的菌株进行质粒检测.挑取质粒消除突变菌株利用LmPH和C12O引物进行PCR扩增，检测突变菌株是否存在LmPH和C12O基因.
2.5 分析方法
2.5.1 细胞浓度的测定
采用可见分光光度法在600 nm下测定培养液的吸光度.
2.5.2 苯酚浓度的测定
采用4-氨基安替比林直接分光光度法测定苯酚的包含比重.
2.5.3 粗酶液活性测定
苯酚羟化酶活性的测定参照文献.分别参考文献检测(检查并测试)邻苯二酚1，2-双加氧酶和邻苯二酚2，3-双加氧酶催化降解邻苯二酚的产物粘糠酸和2-羟基粘糠酸半醛，分别在260 nm和375 nm处有最大吸收峰.C12O和C23O酶活力测定以单位时间内反应产物分别在260 nm和375 nm处吸光度变化表示.反应体系为8.01 mL邻苯二酚、0.39 mL磷酸缓冲液和0.6 mL粗酶液，以缓冲液为参比.定义C12O活力单位为25 ℃条件下每分钟反应产生1 μmol产物所需酶量.总蛋白包含比重用Bradford法测定，具体方法参见全式金Easy Protein Quantitative Kit试剂盒说明书.酶的比活力以每毫克的蛋白质中所含酶的活力单位数计算.
3 结果与讨论
3.1 菌株的分离与纯化
从活性污泥中分离纯化得到单菌落，划线分离后获得58株苯酚降解菌.通过复筛得到一株苯酚降解能力最强的菌株，命名为YH8.在驯化前，菌株YH8在苯酚浓度为1000 mg · L-1的选择培养基中，经30 ℃、200 r · min-1培养2d可使苯酚降解率达到78.54%.采用梯度浓度驯化后，菌株YH8可在4d内使1200 mg · L-1的苯酚降解89.47%.
3.2 菌株的鉴定
3.2.1 形态（pattern)特征鉴定
菌株YH8的菌落呈圆形、浅白色、中间隆起、边缘整齐、湿润有光泽、较透明、较粘稠、不产色素.菌株细胞呈短杆状，有荚膜，无鞭毛与芽孢.经扫描电镜观察该菌在LB和选择培养基生长的菌株细胞差异，正常细胞表面较光滑，而苯酚则使该菌细胞表面出现凹陷.因苯酚在水溶液水解成酸性，高浓度的苯酚对细胞有一定的毒害作用，故选择培养基中培养的细胞易出现破损等现象.
图1 YH8在LB中的扫描电镜图
图2 YH8在苯酚中的扫描电镜图
3.2.2 生理生化鉴定
菌株YH8生理生化指标如下:革兰氏染色阴性、氧(Oxygen)化酶阴性、过氧化氢酶阳性、苯丙氨酸脱氨酶阴性、吲哚实验阴性、淀粉水解阴性、硫化氢阴性、三糖铁阴性、硝酸盐还原阳性、V-P实验阴性、甲基红阴性、明胶液化阳性、纤维素酶阴性，4 ℃可生长，40 ℃不能生长，不具有运动性.将菌株YH8细胞悬浮液接种至BIOLOG GN2板微孔中，培养4h和16h后分别测定菌株代谢指数.经BIOLOG特殊结构：荚膜、鞭毛、菌毛鉴定系统分析，菌株YH8代谢指数与Acinetobacter guillouiae的相似性为94%.
重金属抗性实验发现，菌株YH8能在分别添加1.0 g · L-1 Pb2+、1.5 g · L-1 Cr6+、1.8 g · L-1 Cr3+、0.5 g · L-1 Cd2+、1.0 g · L-1 Sb3+、3.0 g · L-1 Mn2+、1.0 g · L-1 Cu2+和1.0 g · L-1 Zn2+的LB培养基中正常生长，低于1 g · L-1的Cr3+、Mn2+、Zn2+可促进菌株的生长，而Cd2+、Hg2+、Ag+对菌株的生长有强烈的抑制作用.同样，龚斌从含有一定浓度的Cd2+、Pb2+、Mn2+、Ni2+的酚类废水中筛选到一株具有重金属抗性的假单胞菌JF-10，可用于重金属污染水体的苯酚污染生物修复.药敏实验结果表明菌株YH8能耐受5 μ g · mL-1的氯霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、红霉素，而对四环素、庆大霉素、壮观霉素、头孢噻肟钠和利发霉素敏感.菌株在NaCl浓度为1%~12%的选择培养基中生长，表明菌株YH8可适应较高渗透压的环境.
3.2.3 分子生物学鉴定
菌株YH8的16S rDNA经PCR扩增得到一条约1.5Kb的DNA片段，测序得到1448bp的序列，其GenBank登录
号为KM658327.16S rDNA序列BLAST结果表明，菌株YH8与Acinetobacter guillouiae和Acinetobacter lwoffi的16S rDNA序列具有极高的同源性.构建的16S rDNA序列系统发育树表明菌株YH8与多株不动杆菌处在同一个分支.
图3 菌株YH8的16S rDNA基因系统发育树
经PCR扩增获得一段约1.3 kb的DNA片段，测序得到1182bp的序列，其GenBank登录号为KM658329.gyrB序列BLAST结果表明，菌株YH8与Acinetobacter baylyi的gyrB序列具有很高的同源性，而与其它菌株gyrB基因相似性均在98%以下，系统发育分析表明，菌株YH8与Acinetobacter baylyi同处在一分支.因NCBI数据库中暂未收录Acinetobacter guillouiae的gyrB序列数据，故gyrB基因系统进化树中与YH8同一分支中未出现Acinetobacter guillouiae.综合16S rDNA和gyrB基因序列分析以及菌株形态和生理生化特征，菌株YH8鉴定为Acinetobacter guillouiae.
图4 菌株YH8的gyrB基因系统发育树
3.3 苯酚代谢途径及相关降解酶特性测定
3.3.1 降解酶基因扩增
按试剂盒说明从菌株YH8中提取到基因组DNA.分别利用LmP
H、C12
O、C23O引物对菌株YH8的基因组DNA进行PCR扩增，结果发现引物LmP
H、C12O有明显的扩增产物，而C23O引物无明显的扩增产物.将扩增产物测序，获得LmPH基因大小为691 bp的片段，C12O基因大小为359 bp的片段.测序比对结果表明，菌株YH8的LmPH基因序列与登录号为D85083.1的LmPH序列同源性最高，达到97%;该菌株的C12O序列与登录号为Z36909.1的C12O序列同源性最高，达到96%.故证明菌株YH8基因组中包括LmPH和C12O基因.苯酚代谢途径的限速步骤由第一步的苯酚羟化酶的催化决定，自然环境中有单组分和多组分两种苯酚羟化酶，而多组分苯酚羟化酶是自然环境的优势类型.通过染色体步移技术克隆得到 总长约为6 kb的苯酚羟化酶基因，其中ORF4编码苯酚羟化酶大亚基，与编码产碱杆菌苯酚羟化酶大亚基基因的同源性达到93%，为构建高效基因工程菌提供了一定的理论基础.
图5 苯酚羟化酶基因片段和邻苯二酚1，2双加氧酶基因片段的扩增产物
3.3.2 降解酶活性测定
通过测定菌株YH8粗酶液中LmP
H、C12O和C23O的活性，初步判断该菌株YH8降解苯酚的代谢途径.菌株YH8粗酶活性检测表明，菌株YH8在LmPH的催化作用将苯酚转化为邻苯二酚，邻苯二酚在C12O的作用下通过邻位开环裂解途径降解.这与运用气质联用仪分析(Analyse)生物滴滤塔处理后的苯酚气体检测到的结果一致，推测苯酚的转化形式也相同.菌体破碎后上清液中LmPH和C12O的活性远高于未破碎菌体上清液中酶活性，由此可见该酶为胞内酶.以LB培养基为基质的两种上清液均未检测到酶活，而选择培养基中酶活远大于LB培养基中酶活，说明该菌株LmPH和C12O为诱导酶.在研究四溴双酚A的微生物降解特性时，降解TBBPA的菌株H粗酶液中同样检测到一条明显区别于纯培养菌株的蛋白条带，证明红球菌株H相关降解酶是受TBBP诱导的特异性降解酶.
表1 不同基质中苯（化学式：C6H6） 酚相关降解酶比活力
3.3.3 质粒检测和消除结果
采用全式金transgen Plasmid MiniPrep Kit试剂盒抽提菌株细胞中的质粒，1%琼脂糖凝胶电泳检测出现3条目的条带，说明菌株YH8具有一个5 kb左右的质粒.经变温-SDS法消除质粒后，通过点解法得到只能在LB平板上生长而不能在仅含浓度为1000 mg · L-1 苯酚的MS培养基平板上生长的菌株，质粒消除率可达57.73%.经质粒检测，在质粒消除后的突变菌株中未发现质粒.挑取质粒消除突变菌株培养并经PCR扩增检测，无LmPH和C12O基因扩增条带出现.这说明经质粒消除后的菌株不能利用苯酚作为唯一碳源生长，且可初步判定苯酚相关降解基因位于质粒上.结果与对不动杆菌质粒及其特性的研究结果一致.
