X、Dechloromonas和Sulfuritalea.
硫化物具有强烈的毒性和臭味，它的超标排放是目前面临的严峻的环境问题之一.它能够和细胞色素中的金属离子进行反应，进而抑制细胞的呼吸作用.此外，它还具有腐蚀性并产生很高的化学需氧量.硫化物通常在产甲烷的过程中伴随产生，它也产生于多种工业加工过程，例如：石油化工(petrochemical industry)、造纸、制革等.许多物理、化学和电化学方法已经用来处理气体和水中的硫化物，例如：沉淀法、气提、离子交换、电催化氧化（oxidation)、有机溶剂和化学氧化.其中，利用无色硫细菌的生物处理技术具有低成本、低能耗和产物无害等优势（解释:能压倒对方的有利形势).因此，它是一种国际上日益关注的热门技术.Thiobacillus denitrificans被发现能够利用无机硫化合物作为能量来源，无机碳化合物作为碳源进行生长.左剑恶等在升流式生物膜反应器中，利用无色硫细菌处理废水中的硫化物，去除率为90%，单质硫转化率为100%.这类能够利用无机硫化合物的自养反硝化细菌具有较高的研究价值，因为它在反硝化过程中不需要再额外添加有机碳源并节约经济成本.相关技术目前已经得到广泛的应用，例如：市政污水、地表水和垃圾渗滤液的处理.
近年来，多单元联合生物技术快速发展并应用于处理含有碳、氮和硫系化合物的废水.此技术的过程原理为：厌氧发酵阶段硫酸盐还原所产生的硫化物及少量剩余COD在反硝化单元被来自硝化单元的硝酸盐氧化去除.在香港特别行政区，应用此技术已经成功建立了示范工程，主要进行沿海地区高硫酸盐生活污水的脱氮处理.脱氮单元中的活性污泥通常含有自养和异养反硝化细菌，其中有些物种能够利用含硫化合物还原硝化单元所产生的硝酸盐.除能以含硫化合物作为能源的自养反硝化细菌以外，一些异养细菌也被发现具有这样的功能.它们能够利用硫化物和硝酸盐进行呼吸作用，并产生单质硫和氮气作为反应产物.这种生物基单质硫具有亲水的特性，能够作为生产肥料和杀虫剂的原料，具有较高经济价值.
本研究分离1株能够利用硝酸盐作为电子受体，乙酸盐和硫化物作为电子供体进行生长代谢的细菌.在硫化物氧化过程中，单质硫为主要的反应产物.已有的研究结果显示Thauera属的物种是污水处理系统中最活跃的反硝化细菌，但是其硫氧化的生理特性极少有研究报道.本研究揭示菌株HDD1在生态学以及污水处理技术应用中的重要意义.
1 材料与方法1.1 菌株分离与培养条件
活性污泥来源于实验室运行的污水处理生物反应器.分离培养基包括以下物质：Na2S?9H2O，1.5;CH3COONa，0.387 5;KNO3，0.757 5;NH4Cl，1.0;KH2PO4，1.8;Na2HPO4?12H2O，3.0;MgSO4?7H2O，0.1;Agar，1.5.培养基灭菌后加入过滤灭菌的微量元素(trace element)液.采用亨盖特厌氧培养技术结合稀释灭绝法进行菌株的分离和纯化.活性污泥经过梯度稀释以后，接种到含有固体培养基的厌氧管中.在30℃条件下静置培养7 d后，单克隆被接种到液体培养基中进行培养.液体培养基经过煮沸和充入氩气达到厌氧条件，加入L-半胱氨酸和1 mL浓度为0.2%的刃天青作为除氧剂和指示剂.通过(tōng guò)在固-液分离培养基中反复转接得到细菌培养物.通过显微镜观察和16S rRNA基因测序技术检测其是否为纯培养.
1.2 菌株鉴定
采用Bacterial DNA Mini Kit 提取特殊结构：荚膜、鞭毛、菌毛基因组DNA.提取的基因组DNA经分光光度计定量后作为聚合酶链式反应的模板.采用细菌16S rRNA基因通用引物F27和R1492进行扩增反应.反应体系包括Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix ，浓度为20 μmol?L-1的上下游引物，20 ng DNA模板和蒸馏水.采用GeneAmp PCR system 进行扩增反应，具体步骤设置如下：94℃起始变性3 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环.扩增产物经测序后，用BLAST-N程序和原核生物数据库进行比对分析.利用MEGA 5.0软件包，采用邻位相连算法构建系统(system)进化树.进化树的拓扑结构经过1 000次引导重复取样检验.
1.3 生理学和化学分析
细菌经离心收集后，用磷酸盐缓冲液清洗3次，用2.5%戊二醛固定30min.用30%、50%、70%、90%、100%的乙醇（chún）脱水后，以饱和叔丁醇做介质进行真空干燥.利用扫描电子显微镜观察细胞形态.利用生化试剂条检测菌株的生理特征.细胞经过标准革兰氏染色后，用氢氧化钾(Potassium)消散法复检[25].菌体蛋白浓度测定采用Bradford Protein Assay Kit 的标准方法.CH3COO-、NO3-、NO2-、SO42-和S2O32-的浓度由离子色谱测定.S2-的测定采用标准亚甲基蓝分光光度法.利用能量散射谱仪测定单质硫及其含量.菌株的16S rRNA基因序列的GenBank登录号为KX242545.
2 结果与分析2.1 菌株的分离与鉴定
经过5轮固-液分离培养基转接，得到菌株HDD1.在显微镜视野下，细菌的形态呈统一的杆状;16S rRNA基因测序结果中不存在噪声信号，这表明菌株HDD1为纯培养.提交长度为1 397bp的16S rRNA基因序列到数据库进行比对分析，结果显示HDD1与Thauera aminoaromatica S2的相似度最高，达到98.7%.进化树结果显示HDD1在Thauera属中形成一个单源的进化枝，并与Thauera humireducens和Thauera terpenica形成一个进化群.用最大似然算法对系统进化树验证，得到相同结果.这些结果表明菌株HDD1可能是Thauera属的一个新种，但是还需多相分类结果进行验证.
图 1 邻位相连法构建16S rRNA基因系统进化树
2.2 菌株的生理特性
菌（fungus)株HDD1革兰氏染色呈阴性，细胞呈杆状.反硝化作用、吲哚反应和有机酸同化作用呈阳性;糖类水解酸化反应呈阴性.通常Thauera属的各个种是一类兼性厌氧，专性进行呼吸作用的细菌.它们能够利用氧气、氮氧化物作为电子受体，在好氧呼吸和反硝化作用之间转化代谢状态.有些种在厌氧条件下可以还原硒酸盐.很多种能够利用有机酸、氨基酸、芳香和脂肪(fat)类化合物进行生长.它们通常在污水处理厂、江河、池塘沉积（sedimentation)物等被污染的地区被发现.菌株HDD1的生理特征结果和伯杰氏系统微生物学手册中Thauera属的描述相同.
图 2 菌株HDD1扫描电子显微镜图像
表 1 菌株HDD1的生理学特性
2.3 菌株的代谢特性
菌株HDD1在厌氧条件下利用硝酸盐作为电子受体氧化乙酸盐和硫化物.在15 h之内，CH3COO-基本被完全代谢，其浓度由300 mg?L-1下降到20 mg?L-1，菌体蛋白浓度由1.5 μg?mL-1上升到11 μg?mL-1[图 3]，生物量有所增加;NO3-浓度由487 mg?L-1下降到38 mg?L-1，NO2-在第15~20 h之间有短暂的积累，最高浓度为67.7 mg?L-1 [图 3];浓度为200 mg?L-1的S2-被完全代谢，S2O32-和SO42-的浓度略有上升[图 3].S2O32-和SO42-的背景值可能是由于在灭菌过程中发生轻微的氧化导致的.在0~5 h，CH3COO-浓度快速地由300 mg?L-1下降到128 mg?L-1，菌体蛋白浓度由1.5 μg?mL-1上升到5.7 μg?mL-1.在代谢反应初期，活化细菌直接进入对数生长期，生物量快速增加，CH3COO-浓度相应地快速下降.在此阶段，NO3-作为电子受体并没有相应地大幅减少.这是由于在对数生长期，大部分CH3COO-通过同化作用直接合成细胞物质，只有少部分通过与NO3-耦合进行呼吸作用.进入稳定（解释:稳固安定；没有变动)期和衰亡期后，细菌同化作用速率减小，需要产生大量能量维持细胞的生命活动.CH3COO-和S2-作为电子供体耦合NO3-进行呼吸作用，大部分NO3-被代谢消耗.为了限制S2-过度氧化成S2O32-和SO42-，增加单质硫的产量，电子受体NO3-浓度的初始设置较低.它也是工艺实际运行过程中一个重要的参数，根据进水COD含量和活性污泥状态而进行调整.随着硫化物被逐渐氧化，所形成的单质硫逐渐聚集成为直径不同的颗粒[图 4].这些颗粒主要是由
C、
O、S和P等元素组成.其中S元素占总含量的20%;由于样品中存在菌体等有机物，C元素占总量的68.6%;由于培养基中存在磷酸盐等物质，O元素和P元素分别占总含量的9.2%和2.1%[图 4].由于S2O32-和SO42-含量很低，根据化学反应元素平衡原理，硫化物氧化的主要产物为单质硫.硫酸盐被还原成硫化物，硫化物再被氧化，是硫元素生物地球化（退火工艺)学循环中重要的过程.这个过程涉及到多种复杂的反应、硫细菌和酶.无色硫细菌分为4个系统进化世系，3个属于细菌域，1个属于古细菌域.多数的无色硫细菌属于Proteobacteria门的Gammaproteobacteria纲.根据碳源和能量代谢方式，无色硫细菌可以分为不同的生理类型，包括：专性化能无机营养型、兼性化能无机营养型、化能无机异养型和化能有机异养型.化能无机异养型是指能够利用还原性含硫化合物作为能量来源，但是不能固定二氧化碳的细菌.根据生理学特性，菌株HDD1不能利用光能，且只能利用乙酸盐等有机物作为碳源，所以它属于化能异养型微生物.在氧化硫化物过程中其是否获得能量还需进一步验证.原位检测技术结果显示Thauera属在污水处理系统中是一类活跃的反硝化细菌，但是很少有研究报道它们的硫氧化功能.微生物群落分析表明Thauera属在反应器的生态系统中具有很高的丰度，但是由于缺乏菌株的纯培养，深入的生理学特征研究很难开展.在生理学研究中，菌株HDD1可以作为研究Thauera属硫氧化功能的模式种为进一步的研究提供基础;在生态学研究中，它的相关功能基因可以作为分子标记，为搜索复杂群落中的功能微生物提供技术支撑.目前，造纸厂、煤气厂和制药厂等工业废水都含有大量的硫化物.生物法短程氧化硫化物并回收单质硫作为资源具备很多优势.首先，它是化学和化肥工业的原料.其次，和物理化学法相比，生物法更加节约能源和成本.分离并研究功能菌株的生理学特性是这项生物技术应用的重要保障.在这项技术中，菌株HDD1和其他常见的硫氧化细菌，例如：Thiobacillus denitrificans和Paracoccus denitrificans起到关键作用并有待更深入地研究.具体参见污水宝商城资料或
图 3 菌株HDD1的碳氮硫（化学符号：S）化合物代谢
扫描电子显微镜图像;能量色散谱分析图 4 菌株HDD1代谢产物分析
3 结论
在本研究（research)中，从反应器活性污泥中分离纯化出1株特殊结构：荚膜、鞭毛、菌毛HDD1.基于16S rRNA基因的系统进化分析显示，它与Thauera属的物种具有亲缘关系并形成一个单源的进化枝.生理特征实验结果验证表明菌株HDD1是Thauera属的一个种.菌株HDD1能够利用硝酸盐作为电子受体同步氧化硫（化学符号：S）化物和乙酸盐.在15 h之内，浓度为300 mg?L-1的CH3COO-、200 mg?L-1的S2-和487 mg?L-1的NO3-被完全代谢去除.根据其特殊的生理特征，菌株HDD1可以同时应用于处理含有碳(C)、氮、硫系化合物的工业废水及硫元素的资源化回收.
