高效、稳定的亚硝化反应是运行SHARO
N、ANAMMO
X、CANON等新型生物脱氮工艺的先决条件.本课题组的前期研究表明，培养具有亚硝化功能的完全自养型好氧颗粒污泥，有利于实现对氨氧化菌的高度富集，以突破当前限制“亚硝化路线”的技术瓶颈.
作为实现污泥颗粒化的关键步骤（procedure)，胞外聚合物的累积不仅是微生物适应外界环境变化、保障(起保障作用的事物)自身聚集生长的必要条件，也是影响污泥形态结构与降解活性的重要因素.因此，建立环境因素、污泥性状与EPS组成的相互关系，对完善、优化现有污水生物处理理论与技术具有重大意义.值得注意的是，EPS的化学组成与提取方法、污泥种类密切相关.目前，国内外鲜有关于亚硝化颗粒污泥EPS组成特性的报道.因此，有必要选出合适的提取方法并对其EPS组成进行分析.
本研究以异养型好氧颗粒污泥、普通活性污泥和厌氧颗粒污泥为参照，分别考察离心法、加热法、热碱法、甲醛-NaOH法和甲醛-热碱法对亚硝化颗粒污泥中EPS组分的提取效果，以选出最佳方法，并利用蛋白质/多糖含量测定、三维荧光与傅里叶红外光谱等表征手段，比较分析GNS有别于其他污泥样品的EPS组成特性，以期为探究完全自养型好氧颗粒污泥的形成机理与形态特征提供参考.
2 材料与方法
2.1 污泥样品
本研究所选污泥样品的种类、来源与性质如表 1所示.其中，AS是实验室培养GNS和AGS的接种污泥.
表 1 4类污泥样品的来源与性质
2.2 EPS的提取方法
2.2.1 样品预处理
采用离心预处理去除污泥样品液中的可溶性有机物.取20 mL污泥液，在4 ℃、10000 r?min-1条件下离心10 min，弃去上清液，并使固体重新悬浮于中性磷酸缓冲溶液中，重复上述操作控制1次，所得样品待用.随后，对所有颗粒污泥均进行了超声处理，即在冰水浴、功率35 W条件下，超声4 min.
2.2.2 EPHOTOSHOP的提取方法与流程
为保证研究结果与文献报道的可比性，本文选择了5种常用的EPHOTOSHOP提取方法，并建立对照法，具体操作控制过程如图 1所示.
图 1 EPS提取方法的流程
2.3 EPS的组分分析
在本研究中，EPS总量是指PN与PS质量浓度之和，单位为 mg?g-1.蛋白质含量采用Lowry法测定，以牛血清蛋白作为标准物质.多糖浓度采用苯酚-硫酸法测定，以葡萄糖作为标准物质.P
N、PS的测定结果取3次平均值.污泥浓度采用标准重量法测定.EPS提取液中的总有机碳采用耶拿元素分析仪测定，并作为表征污泥EPS总量的辅助性指标.
三维荧光光谱测定步骤（procedure)：以Milli-Q纯水为空白，使用1 cm荧光池在Cary Eclipse荧光分光光度计的同步扫描模式下进行分析.光电倍增管电压为500 V，激发和发射狭缝宽度均为5 nm，激发波长和发射波长分别为200~400 nm和200~600 nm，扫描间隔均为10 nm，扫描速度1200 nm?min-1，峰强度最大量程为1000 A.U.采用Origin 8.5绘制等高线图.
傅里叶红外光谱测定步骤：将EPS提取液置于冷冻干燥机中24 h，对固体进行仔细研磨，并按1 ∶ 100的质量比与高纯度KBr混合后压片，使用Thermo傅里叶变换红外光谱进行分析.
3 结果
3.1 亚硝化颗粒污泥EPS的提取结果
如表 2所示，对于亚硝化颗粒污泥而言，各提取方法所获得的EPS总量遵循：热碱法>甲醛-NaOH法>加热法>甲醛-热碱法>离心法>对照法.对参照污泥的提取结果也大体如此.
表 2 采用不同方法对4类污泥样品EPS的提取结果
作为颗粒污泥中重要的结构性组分，蛋白质和多糖通常可以占到污泥EPS总量的70%以上.由图 2可知，无论采用何种提取方法，亚硝化颗粒污泥EPS中PN/PS比值始终大于1.其中，离心法是一种较为温和的提取方法，其结果仅代表松散结合的胞外聚合物含量，后者对污泥的絮凝、脱水性能有直接影响.相比之下，经热碱法处理后，污泥有明显的破胞现象，提取液呈棕黄色，TOC浓度很高，大量蛋白质的溶出导致PN/PS比值高达8.4.参照污泥的EPS提取过程也存在类似现象，这与张丽丽等对好氧颗粒污泥EPS提取方法的研究结果一致.同样使PN/PS比值偏高的还有加热法，具体表现为对多糖的提取效果较差.如果预先投加适量甲醛(aldehyde)，起到固定与缓冲作用，将有效降低高温、强碱对细胞结构的破坏，使水相中DNA等胞内物质含量与胞浆酶活性均处于较低水平.在本研究中，甲醛-NaOH法对污泥EPS的提取量仅次于热碱法，且PN/PS比值与对照组结果接近.根据文献报道，甲醛-NaOH法提取的DNA浓度在0.1~3.3 mg?g-1，远小于热碱法和加热法的对应值，但高于离心法的0.05~0.5 mg?g-1.本研究提出的甲醛-热碱法对亚硝化颗粒污泥EPS的提取结果与甲醛-NaOH法相当，提取时间缩短了近60%，但甲醛-热碱法对参照污泥中蛋白质的提取效果并不理想.
图 2 4类污泥样品EPHOTOSHOP中蛋白质与多糖的含量
由表 2可知，当采用相同的提取方法时，4类污泥的EPHOTOSHOP含量大体遵循：AGS>AS>AnGS>GNS.出于维持特殊结构的需要，好氧颗粒污泥的EPS以紧密结合的胞外聚合物为主，其总量远高于活性污泥的水平.其次，当污泥从好氧转至厌氧环境中，部分EPS将以碳源、能源的形式被消耗掉，因而，厌氧颗粒污泥的EPS总量不高，并含有较多的腐殖酸类物质.相比之下，比生长速率仅为0.32~0.76 d-1的AOB等自养菌常被认为不能产生充足的EPS，以保障其独立完成颗粒化过程.即使在稳定运行100 d以上的完全自养硝化颗粒污泥中，异养菌仍具有一定的活性，并对维持污泥结构的稳定起到积极作用.最近，戴昕利用PCR-DGG
E、454高通量测序和qPCR等分子生物学手段证明，AGS形成过程中定向分泌的胞外蛋白质主要来自高度富集的Zoogloea spp.菌株.而Wu等的研究也表明，将反应器进水COD/NH4+-N控制在1~2之间，20 d内即可获得成熟的硝化颗粒污泥，高比例的多糖成分对于生长周期较长、附着能力较差的硝化细菌起到了很好的固定(fixed)作用.本研究发现，亚硝化颗粒污泥的EPS组成也具有类似特点.当采用甲醛-NaOH法进行提取时，GNS的PS/PN比例为0.77，远高于其他污泥样品.
3.2 亚硝化颗粒污泥EPHOTOSHOP的三维荧光分析
在统一采用甲醛-NaOH法的前提下，对4类污泥样品的EPS进行三维荧光光谱分析，结果如图 3所示.依据Chen等总结的3D-EEMs图谱分析方法，可以获得荧光特征峰的相关参数，具体见表 3.从图谱形状与特征峰位置来看，亚硝化颗粒污泥与异养型好氧颗粒污泥的结果非常接近，强荧光峰均主要来自可溶性微生物代谢产物和芳香类蛋白质，这也体现了两者在颗粒形态结构上的相似性.尽管普通活性污泥的EPS也含有同类型的荧光峰，但峰强要低得多，这意味着颗粒污泥具有比絮状污泥更高的微生物活性和更多的结构性蛋白的研究结果表明，颗粒污泥较絮状污泥含有更丰富的酪氨酸、色氨酸等芳香 类蛋白，该类物质有利于促进细胞聚集和增强颗粒的稳定性.另外，本研究选取的好氧颗粒污泥是以简单化合物为碳(C)源和氮源.因此，好氧颗粒污泥EPS的3D-EEMs图谱中并未找到厌氧颗粒污泥中常见的类腐殖酸峰.Zhu等发现，在污泥颗粒化过程中，类腐殖酸峰的强度呈现先增强后减弱的变化趋势（trend)，并认为除了进水水质的影响以外，颗粒污泥EPS中腐殖酸的含量与其成熟度存在一定的关联性.
图 3 4类污泥样品EPHOTOSHOP的三维荧光图谱
表 3 污泥样品EPS的荧光特性分析(Analyse)
3.3 亚硝化颗粒污泥EPS的傅里叶红外分析
在相同前提下，对4类污泥样品的EPS进行傅里叶红外光谱分析，结果如图 4所示.波长在1000 cm-1以内的指纹区特征峰大多由含硫、磷的不饱和键发出，而蛋白质、多糖等EPS组分主要集中于1000~1800 cm-1区间.其中，1070、1296 cm-1附近的特征峰分别由多个C―O不对称伸缩振动和O―H变形振动引起，均明确指向多糖组分.1454、1610和3430 cm-1则对应于蛋白质中常见的C―O
H、H―N―H和N―H等酰胺类基团，1667 cm-1更是与蛋白质二级结构Amide III密切相关.
图 4 4类污泥样品EPS的傅里叶红外光谱图
与3D-EEMs的结果类似，亚硝化颗粒污泥EPHOTOSHOP的红外特征峰位置与异养好氧颗粒污泥基本一致，但前者的峰强更高.相比之下，普通活性污泥与厌氧颗粒污泥的峰型更为杂乱.这说明污泥颗粒化过程(guò chéng)在对微生物种类进行选择性“淘洗”的同时，也简化了胞外聚合物的组成.对于AnGS而言，EPS中的腐殖酸会在一定程度上干扰PN与PS对应特征峰的定位.具体参见污水宝商城资料或
4 结论
1)不同方法对亚硝化颗粒污泥EPS的提取总量遵循：热碱法>甲醛-NaOH法>加热法>甲醛-热碱法>离心法>对照法.其中，甲醛-NaOH法能在有效保护细胞结构的同时，获得较高的EPS提取效率，浓度值为mg?g-1.耗时更短的甲醛-热碱法对亚硝化颗粒污泥同样适用，但其对参照污泥的提取结果并不理想.
2)在本研究中，亚硝化颗粒污泥的EPS总量最低，这可能与自养菌分泌EPS的能力较弱有关.但在GNS的EPS组分中，PS/PN比值为0.77，远高于以异养微生物为主的其他污泥样品，丰富的多糖成分对于生长周期较长、附着能力较差的氨（化学式：NH3） 氧(Oxygen)化菌能起到较好的固定作用.
3)由3D-EEMs和FT-IR图谱可知，亚硝化颗粒污泥EPS的荧光特征与异养型好氧颗粒污泥非常类似，特征峰均主要来自可溶性微生物代谢产物和芳香类蛋白质.与普通活性污泥相比，亚硝化颗粒污泥具有更高的微生物活性和更丰富的结构性蛋白，且EPS组成也更为简单.
